Способ получения пептидов

 

Изобретение касается пептидов и, в частности получения соединений общей ф-лы I: H-TYR-ALA-ASP-ALA-ILE-PHE-THR-ASN-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU-GLY-GLN-LEU-SER-ALA-ARG-LYS-LEU-GLN-ASP-ILE-MET-R-X, где X-OH или NH<SB POS="POST">2</SB>

R=а)-SER-ARG-GLN-GLN

б)-SER=ARG-GLN-GLN-GLY-GLU-SER

в)-SER-ARG-GLN-GLN-GLU-SER-ASN -GLN-GLU

г)-SER-ARG-GLN-GLN-GLY-GLU-SER-ASN-GLN-GLU-ARG-GLY-ALA

д)-SER-ARG-GLN-GLN-GLY-GLU-SER-ASN-GLN-GLU-ARG-GLY-ALA-ARG-ALA-ARG-LEU, которые способны вызывать секрецию природного гормона роста, что может быть использовано в медицине. Цель изобретения - создание новых малотоксичных и активных пептидов. Их синтез ведут присоединением к полимерной смоле МБГА или полистирольной смоле N-защищенной аминокислоты общей формулы BOC-HN-C(R<SB POS="POST">1</SB> R<SB POS="POST">2</SB>)COOH, где R<SB POS="POST">1</SB>-H

R<SB POS="POST">2</SB>-CH<SB POS="POST">3</SB>, -CH<SB POS="POST">2</SB>OH,-CH<SB POS="POST">2</SB>CH(CH<SB POS="POST">3</SB>)<SB POS="POST">2</SB>, -CH<SB POS="POST">2</SB>CH<SB POS="POST">2</SB>CONH<SB POS="POST">2</SB>, -CH<SB POS="POST">2</SB>CH<SB POS="POST">2</SB>COOH. Затем продукт деблокируют и проводят постепенное наращивание пептидной последовательности в соответствии с формулой I. Далее отщепляют носитель и деблокируют полученный пептидилполимер общей формулы X<SB POS="POST">1</SB>TYR(X<SB POS="POST">2</SB>)-ALA-ASP(X<SB POS="POST">3</SB>)-ALA-ILE-PHE-THR(X<SB POS="POST">4</SB>)-ASN-SER(X<SB POS="POST">4</SB>)-TYR(X<SB POS="POST">2</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">5</SB>)-LYS(X<SB POS="POST">6</SB>)-VAL-LEU-GLY-GLN-LEU-SER(X<SB POS="POST">4</SB>)-ALA-ARG(X<SB POS="POST">5</SB>)-LYS(X<SB POS="POST">6</SB>)-LEU-LEU-GLN-ASP(X<SB POS="POST">3</SB>)-ILE-MET-R-X, где X - O-CH<SB POS="POST">2</SB>-бензилполистирольная смола или NH-смола МБГА

X<SB POS="POST">1</SB> - бензилоксикарбонил

X<SB POS="POST">2</SB>- 2,6-дихлорбензил

X<SB POS="POST">3</SB> - сложный бензиловый эфир

X<SB POS="POST">4</SB> - бензил

X<SB POS="POST">5</SB> - тозил

X<SB POS="POST">6</SB> - 2C1-Z

R -см.выше. Новые вещества оказывают влияние на секрецию гипофизарных желез, что может быть использовано для промотирования роста теплокровных и холоднокровных животных в сельском хозяйстве, а также в диагностической практике. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

I (21) 3611593/23-04 (22) 15.06.83 (31) PCT/US82/00812; 418248 (32) 16,,06 ° 82; 15.09.82 (33) US (46) 23.12.89. Бюл. и 47 (71) Дзе Салк институт фор Биолоджикал Стализ (US) (72) Николас Чай-Кван Линг, Фредерик Стефен Еск (US), Петер Болен (СН), Поль Эрнест Бразо-младший (СА) и Роджер Чарльз

Луис Гвиллемин (US) (53) 547.964„4.07(088,8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов и, в частности, получения соединений общей ф-лы I: Н-Tyr-Аlа-Asp-Ala-IlePhe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Àrg-Lys-Val-LeuGly-G1n-Leu-Ser-A1а-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-11е-Net-R-X, где Х-ОН или

NH R-а)-Ser-Arg-Gln-Gln; б)-SerArg-G1n-Gln-G1y-G1u-Ser; в) -SerArg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-GlnGlu; г) -Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-SerAsn-G1n-Glu-Arg-Gly-Ala; д)-SerArg-Gln-G1n-Gly-G1u-Ser-Asn-СlпGlu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu, которые способны вызывать секрецию природного гормона роста, что может быть

Изобретение относится к способу получения пептидов новых биологически активных соединений, которые могут н<.1ти применение в медицине.

Цель изобретения — разработка способа получения новых производных пеп„„SU„„1531857 А (59 4 С 07 К 7/00//А 61 К 37/02

2 использовано в медицине. Цель изобретения — создание новых малотоксичных и активных пептидов. Их синтез ведут присоединением к полимерной смоле МБГА или полистирольной смоле

N-защищенной аминокислоты общей ф-лы

Вос-HN- (R,R )СООН, где R,-H; К -СН

-сн,он, -сн,сн(сн,)„ -сн,сн,coNHÄ

-СН,СНгCGOH. Затем продут деблокируют и проводят постепенное наращивание пептидной последовательности в соответствии с ф-лой I. Далее отщепляют носитель и деблокируют полученный пептидилполимер общей ф-лы yr(X<)Ala-Asр(Хз)-Ala-Ile-Phe-Thr(Х+)-AsпSer(X<)-Туг(Х )-Arg(X+)-Lys(Х )-ValLeu-Gly-G1n-Leu-Ser(Х<)-Alà-Arg(X>)—

Lys(Х6)-Leu-Leu-Gln -Asр(Хз)-Тle-MetR-X, где Х-ОСН -бензилполистирольная смола или NH — смола МБГА; Х, — бензилоксикарбонил; Х вЂ” 2,6-дихлорбенэил; Х вЂ” сложный бенэиловый эфир; Б

Х Ф вЂ” бензил; Х 5 — TO3HJI; Х 6

2сl-l.; К вЂ” см. выше. Новые ве- О б щества оказывают влияние на секрецию гипофизарных желез, что может быть ф ) использовано для промотирования роста теплокровных и холоднокровных животных в сельском хозяйстве, а также в диагностической практике. 2 табл. тидов — малотоксичных, облацающцх способностью вызывать секрецию природного GH, но более доступных соединений.

Пример 1. Синтез PGRF(1-44) свободной кислоты, имеющей формулу

15 3185 7 бензилоксикарбонил;

2,6-дихлорбензил; сложный бензиловый эфир;

Г>ензил; где Х<

Х

Х

X е

Н-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-As nSe r.-Tyr-Arg-Lys -Val-Leu-G1ó-G1nLeu-Ser-Ala-Arg-Lys-I,eu-Leu-G1n-.

As p-Il e — Met-Ser-Arg-Gln-Gln-G1yGlu-Ser-Asn-G1n-Glu-Arg-Gly-AlaArg-Ala-Arg-Leu, осуществляется поэтапно с использованием пептидного синтезатора Бекмана 990 на основе хлорметилированной смолы, которая поставляется из "Lab. Systems 1пс.", с содержанием 0,9 Мэкв Сl/г. Соединение BOG-Leu со смолой получают согласно процедуре, описанной ниже, и это приводит в результате к замещению примерно 0,22 ммоль Leu на 1 r смолы. Все используемые растворители тщательно дегазируют путем пропускания инертного газа, предпочтительно гелия, с тем чтобы гарантировать отсутствие кислорода, который может нежелательно окислять серу группы Met

После снятия защиты и нейтрализации пептидную цепь поэтапно встраивают в смолу. Снятие защиты, нейтрализация и введение каждой аминокислоты обычно осуществляют согласно процедуре, описанной в табл. 1.

Для реакции соединения на 1 г смолы используют 1 ммоль BOG-защищенной

30 аминокислоты в хлористом метилене плюс 1 экв. 0,5 М ДСС1 в хлористом— метилене или 30% ДМЕ в хлористом метилене, реакция протекает в течение

2 ч. При соединении с Arg используют смесь 10% ДМГ с хлористым метиленом, 35 используют как защитную группу с гидроксильной боковой цепью для Ser u

Thr. 2-хлор-бензилоксикарбонил (2С1Z) используют как защитную группу для боковой цепи Lys. ToS используется для40 защиты гуанидиногруппы Arg, и Gln или Asp карбоксильная группа защищена как Bzl эфир. Г»»дроксильная фенольная группа Tyr защищена как 2,6-дихлорбензил, По окончании данного синтеза

45 получают следующее соединение:

Х < -Туг (Х ) -Al а-As р (Х > ) -Al а-I l eIhl-Thr (Х ) — Asn-Se г(Х ) -Tyr(X )—

Arg (Xs) -Lys (X>) -Val-Leu-Gly-G1nLeu-Ser(X<) — Ala-Arg(Xs) -Lys (Х7) — 50

Leu-Leu-G1 n-As р (Х q) -Il е-Met-Se r (Х )—

Arg(Xs)-Gln-Gin-Gly-Glu(X>)-Ser(X<)—

Asn-G1n-Glu(Хз)-Arg(Х6)-Gly-AlaArg(Х6)-Ala-Arg(Х6)-Leu-Х, Х вЂ” тозил

5 У

Х6 — 2сl-к;

Х вЂ” Х-0-СН -бензоллолистирольный смоля»»ой носитель.

После того как последняя Tyr группа соединена со смолой, группу BOG удаляют посредством 45% TFA в СН Сl .

Для того, чтобы отщепить и снять защиту с оставшейся защищенной пептидом смолы, ее обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,25 мл метилэтилсульфида (MES) и 10 мл фтористого водорода (HF) на

1 r лептида — смолы при температуре

-20 С в течение 30 мин и при О С также в течение 30 мин, После удаления HF в высоком вакууме оставшуюся смолу — лелтид промывают поочередно обезвоженным диэтиловым эфиром и хлороформом, и пелтид затем экстрагируют дегазированной 2 н. уксусной кислотой. В результате лиофилизации экстракта уксусной кислоты получают белое мягкое вещество, Отщелленньп» и лишенный эа»»»»»ть» лелтид затем растворяют в 30%-ной уксусной кислоте и подвергают гель-фильтрации на тонком геле Sephadex С-50 !

Данный пептид затем дополнительно очищают посредством катионообменной хроматографии с использованием карбоксиметилцеллюлозы СМ-32 _#_ atman (18х18 см, У,„„= 50 мл), и с использованием вогнутого наклона, образуемого путем закапывания 1 л 0,4 И

NH

NHtOAc, рН = 4,5. Окончательную очистку осуществляют посредством распределительной хроматографии на носителе Phacmain тонкого порошка Sephadex

G-50 с использованием системы растворителей HB4OH: EtOH: лиридин:

0,2%NHOAc 4:1:1:7. Хроматографические фракции тщательно разделяют методом тонкослойной (TI.Ñ) хроматографии с использованием 0,25 мм толщины предварительно покрытых стеклянных пластин, силикагеля 60 без флюоресцентного индикатора, проявление осуществляется с помощью системы растворителей: 1-бутанол, пири»и»», уксусная кислота, вода 6:6:1,2:4,8. Пластины

TLC окончательно проявляются посредством 2 г нингидрлна в 50 мл уксусной кислоты и 950 мл 1-бутанола. Величина R составл .ет 0,464. Собирают лишь те фракции, »> т< рыс. не показывают значительную» т<»»е»>» истоты.

40

Выход продукта 80 мг на каждый 1 r полистироловой смолы.

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза в запаянных труб5 ках уже известным в данной области методом с использованием аминокислотного анализатора Liguimat .с целью проверки правильности получаемой последовательности, при этом получают следующие результаты: Agx (3,62), Thr (0,75), Ser (3,5), Glx (6,83), Gly (2,87), Аlа (5,10), Val (0,9), Met (1,23), Ile (1,84), Leu (5,045), Tyr (2,09), Phe (0,91), Lys (2,31), Arg (6,61)„ Анализ подтверждает правильную последовательность, Определяют вращение плоскости поляризации света, и получают следующие результаты: (oLJ = -65,6+1 (С

1,30%-ная уксусная кислота).

Пример 2. Осуществляют поэтапно синтез PGRF(1-40) формулы НTyr-Ala-Asр-Ala-I1е-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Чаl-Leu-Gly-ГlnLeu-Ser-Ala-Arg-Lys-1,eu-Leu-G1nAsp-Ile-Met-Ser-Arg-Сlп-Gln-GlyGlu-Ser-Азп-Gln-Glu-Arg-Gly-AlaOH, используя пептидный синтезатор Бекмана 990 на основе хлорметилированной смолы. Синтез осуществляют аналогично примеру 1. Выход продукта составляет 37 мг на каждый 1 г смолы.

В результате обработки методами тон35 кослойной хроматографии (TLC) и жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC) пептид абсолютно чист.

Величина R измеренная аналогично примеру 1, составляет 0,414 °

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности, при этом получают следующие результаты: Agx (3,89), Thr (0,88), Ser (3,66), Glx (7,04), Gly (3,07), Ala (4,02), Val (0,96), Met (1,01), Ile (1,86), Leu (4,28), Tyr (2,0), Phe (0,86), Lys (2,24) и Arg (4,15) . Анализ подтверждает т правильную последовательность.(oLJ

= -64,0+1Пример 3. Осуществляют поэтапно синтез PGRF(1-34) — свободной кислоты имеющей формулу Н-Туг-Ala-AspФ

Аlа-Ile-Phe-Thr-Азп-Ser-Tyr-Arg LysЧаl-Leu-G ly-G ln-Leu-Se r-Ala-Arg-LysLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-GlnСlп-Gly-Glu-Ser-ОН с использованием

857 пептидного синтезатора Бекмана 990 на основе хлорметилированной смолы. Синтез проводят аналогично примеру 1.

Выход продукта 121 мг на каждый 1 r смолы. В результате обработки методами тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения пептид, как показал анализ, практически чистый продукт. Величина R составляет 0,500.

Аминокислотннй анализ осуществляюют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности, при этом получают следующие результаты: Agx (2,87), Thr (0,78), Ser (3,78), Glx (5,11), Gly (1,93), Ala (3,03), Val (0,88), Met (0,96), Ile (1,88), l.eu (4,14), Туг (2,05), Phe (1,07), Lys (2,29) и Arg (3,22). Анализ подтверждает правильную последовательность.(< ) =- -60,8+1.

2г

Пример 3. Осуществляют поэтапно синтез PGRF (1-31) -свободной кисл оты, имеющей формулу

Н- Ty r-Al a-As p-Al a-I l e-Ph e- Th r-As nSer-Tyr-Arg-1.ys-Va1-Leu-G1 y-Gln-1.euSer-Al a-Arg-Lys-Leu-l,еи-Gln-As р-11еMet-Ser-Arg-Gln-Гlп-ОН с использованием пептидного синтезатора Бекмана

990 на основе хлорметилированной смолы. Синтез проводят аналогично примеру 1. Выход продукта составлял

143 мг на каждый 1 г смолы. В результате обработки методами тснкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина R< равна 0,536, Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности. Анализ показывает следующие результаты: Agx (2,73), Thr (0,75), Ser (2,77), Glx (3,95), Gly (0,98), Ala (3 06), Val (0,80), Met (0,98), Ile (1,77), Leu (4,28), Туг (2,23), Phe (1,14), Lys (2,34) и Arg (3,22). Анализ подтверждает

- 22 правильную последовательность. (oL ) в

= -65,0+1.

Пример 5. Осуществляют поэтапно синтез GRF(1-44)-амида, имеющего следующую формулу: Н-Tyr-АlаAsp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Туг-Arg—

Lys-Чаl-Leu-61у-Gln-Leu-Ser-AlаArg-Lys-Leu-Leu- Gln-Asp-Ile- 1etSer-Arg-G1п-G1n-Gly-Glu-Seг-Asn-(;1п1531857

Glu-Arg-С 1 у-Аlа-Arg-Ala-Arg-Leu-NH с использованием пептидного синтезатора Бекмана 990 иа основе

6 г смолы МВНА, с использованием тех же операций (изложенных в виде табл. 1), что и в примере 1. Смолупептид обрабатывают 10 -ным анизолом в HF плюс MCS, как и в примере 1.

После отделения смолы и ее промывки пептид экстрагируют уксусной кислотой и затем лиофилизируют. После очистки методом гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и затем распределительной хроматографии получают 321,4 мг пептида, выход которого составляет 54 мг на 1 г смолы. B результате обработки методом тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения данный пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина К составляла 0,464 °

Аминокислотный анализ осуществля- 25 ют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности, при этом получают следующие результаты: Agx (3,75), Thr (0,80), Ser (3,60), Glx (6,98), Gly (3,16)., Ala (5,04), Ча1 (0,77), Met (1,02), Ile (1, 79), Leu (5, 41), Tyr (2,03), Phe (0,84), Lys (2,39) и Arg (6,43) . Анализ подтверждает

- гг правильную последовательность.(eL

= -63,1+1.

Пример 6. Осуществляют поэтапно синтез PGRF (1-40)-амида, имеющего формулу Н-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-PheThr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly40

Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-1.еи-С1пAsp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-G1n-Gly-GluSer-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Аlа- ИНг, используя пептидный синтезатор Бекмана 990 на основе МВЕ1А смолы. Синтез

45 осуществляют аналогично примеру 3.

Выход продукта 60 мг на каждый 1 r смолы. В результате обработки методами тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения получаемый пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина

Rl составляет 0,464.

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности, анализ показывает следующие результаты: Agx (3,76), Thr (0,88) Ser (3,68), Glx (6,89), Gly (3,12), Ala (4,08), Val (0,88), Met (1,36), Ile (1,76), 1.еи (4,24), Tyr (2,00), Phe (0,80), 1.ys (2,32) и Arg (4,16) °

Анализ подтверждает правильную последовательность.(с4) = -62,2+1.

Пример 7. Осуществляют поэтапно синтез GRF(1-37)-свободной кислоты, имеющей формулу H-Tyr-AlaAsр-Alа-Ile-Phe-Thr-Asu-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Gly-Glu-Leu-Ser1

Ala-Агg-Lys-Leu-Leu-G ln-Asp-I le-Me tSe r-Ar g-С ln-G l n-С 1 у-С l и- Se г-As uGln-Glu-0H, с использованием пептидного синтезатора Бекмана 990 на основе хлорметилированной смолы. Синтез осуществляют аналогично примеру 1.

Выход продукта 29 мг на каждый 1 г смолы. В результате обработки методами тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения получаемый пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина К1 составляет 0,421.

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности, анализ показывает следующие результаты: Agx (3,92), Thr (0,79), Ser (3,62), С1х (7,05), Gly (1,97), Аlа (3,17) Val (1 03)

Met (1,0), Ile (1,91), Leu (4,37), Tyr (1,86) 1 Ье (0,76), 1.ys (2,15), и Arg (3,40). Анализ подтверждает L = правильную последовательность. Pa)

= -61,7+1.

37

Пример 8. Осуществляют поэ— тапио синтез GRF (1-37)-амида, имеющего формулу Н-Tyr-Ala-Asp-Аlа-IlePhe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-ValLeu-Gly-Gln-I.eu-Ser-А1а-Arg-Lys-LeuLeu-Сlп-Asр-Ilе-Met-Seг-Arg-Gln-GlnG1u- Ser-Asn-С1u-G)u-Glu-ИНг, используя пептидный синтезатор Бекмана

990 на основе MBHA смолы. Синтез осуществляют аналогично примеру 1.

Выход продукта 25 мг на каждый 1 r смолы, B результате обработки методами тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения получаемый пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина К1 составляет 0,507 °

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой послеповате1531857

10 льности,анализ показывает следующие результаты: Agx (4, 02), Th r (0 80), Ser (3,49), Glx (6,90), Gly (1,92), Ala (3,08), Val (1,05), Met (1,01), Ile (1,77), Leu (4,05), Tyr (2,02), Phe (1,14), l,ys (2,50) и Arg (3,27). Анализ подтверждает правильную последовательность.(k)" = -63,3+1.

Проводят биологические испытания 1ð полученных пептидов.

Полученные результаты подтверждают низкую токсичность пептидов, синтезированных в условиях пРедлагаемого способа, и биологическую активность, выражающуюся в способности вызывать секрецию природного гормона роста.

Для определения эффективности пептида в ускорении выделения гормона роста проводят анализ в условиях 15

"ин витро" с использованием синтетического GRF (1-40) из примера 2 в сопоставлении с равномолярными концентрациями экстрагированного и очищенного естественного GRF (1-40) и в 20 сопоставлении с контрольным стандартом GRF, имеющим уже известную эффективность в ускорении выделения гормона из гипофизарных клеток. Контрольный стандарт представляет собой препарат, полученный от гипоталамуса крысы, который дает половину от максимальной реакции в отношении выделения СН при анализе многослойной биопробы гипофизарной клетки. 30

Используют культуры, включающие клетки гипофизарных желез крысы, которые были предварительно удалены за

4-5 дней. Обе культуры определяемой стандартной среды и культуры, которые рассматриваются оптимальными для секреции гормона роста, используются для сравнительного испытания общепринятым образом, Инкубацию подвергаемого испытанию вещества осущест- 4р вляют в течение 3-4 ч, аликвоты среды выращивания удаляют и подвергают обработке с целью определения их содержания в иммунореактивном (irGH) хорошо охарактеризованным методом радиоиммунопробы.

Биоактивность аналогов hpGRF in

vitro (изучение клеток гипофиза крыс), относительные эффективности аналогов hp GRF-44-NH с исключенным окон- чанием — СООН даны в табл. 2. формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы I

А-Tyr-Ala-Asр- Аlа-Ile-Phe-Thr-АзпSer-Tyr-Arg-I1e-Va1-Leu-Сlу-GlnLeu-Ser-Ala-Arg-Lys-1.еи-1,eu-Gln-As pI1e-Met-R-x, где Х вЂ” ОН, Нн ;

R-Ser-Arg-Сlп-Gln;

Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser;

Ser-Asn-Сlп-Сlп-Сlу-Glu-Ser-AsnСlп-Glu

Ser-Arg-Gln-Gln-G1y-Glu-Ser-Asn-GlnGlu-Arg-Gly-Ala;

Ser-Arg-Gln-G1n-G1y-Glu-Ser-Asn-СlпGlu-Arg-ply-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu, отличающийся тем, что, Я-защищенную аминокислоту общей формулы II

Вос-HN-C(R, R ) СООН где R -Н;

R ÑH,,-СН,ОН, -СН,СН(СН,),, СН СЙ2СОИН, СН СН СООН присоединяют к полимерной смоле МБГА или бензилполистирольной, деблокируют и осуществляют постепенное наращивание пептидной последовательности в соответствии с общей формулой I u от полученного при этом пептидилполимера общей формулы III

Х Tyr(Х )-Alа-Asр(Х )-Ala-Ile-PheTnr(Ха)-Asn-Ser(Хе)-Туг(Х )-Arg(X )—

Lys(X<)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(XQ)Alа-Arg(Х )-Lys(Х6)-Leu-Leu-G1nAs р (Х >) -I l e-Me t-R-X, где Х вЂ” О- СН - бензилполистирольная смола;

NH — смола КБГА

Х< — бензилоксикарбонил;

Х -2, 6 — дихлорбензил;

Х вЂ” сложный бензиловый эфир;

Х вЂ” бензил;

Х вЂ” тозил е

Х вЂ” 201-2;

R — имеет указанные значения, отщепляют полимер-носитель и защитные группы.

Приоритет по признакам:

16.06.82 при R — Ser-Arg-Сlп-Сlп;

Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser; SerAsn-Gln-G1n-Gly-Сlu-Ser-Asп-С1n-G1u..

R --Ser-Arg-G1n-G1n-Сlу-Glu-Ser-AsnGln-Glu-Arg-Gly-Ala; 15,09.82 при

R-Ser-Arg-Gin In-Gly-Glu-Ser-AsnСlп-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu.

1531857

Та блица 1

Реагенты .и операции

Время смешивания, мин

Этап

0,5

Промывка СН С1 (2 раза)

50Х трифторуксусная кислота + 5Х

1,2-этандитиол в CH Cl (1-кратно)

50Х трифторуксусная кислота (TFA)+

+ 5X 1,2-этандитиол в CH С1 (1-кратно)

Промывка СН С1 (3 раза)

Промывка СН ОН (2 раза)

10Х. триэтиламин (Et N) в CHzClz, нейтрализация (2 раза)

Промывка СН ОН (2 раза)

10Х триэтиламин (Et N) с СН С1, нейтрализация (2 раза)

Промывка СН ОН (2 раза)

Промывка СН С1 (2 раза)

ВОС -аминокислота (1 ммоль/г смолы) плюс эквивалентное количество дициклогексилкарбодиимида (ДСС) в

Снас12

Промывка СН С1 (1-кратно)

50Х диметилформамид в СН С1 (2кратная промывка)

Промывка 10Х триэтиламином (Et>N) в СН С1д (1-кратно)

Проьывка СН ОН (2 раза)

Промывка СН С1 (2 раза)

25Х уксусный ангидрид в СН С1 (2 мл/(смолы)

Промывка СН С1 (2 раза)

Промывка СИ ОН (2 раза) 0,5

20,0

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

11

0,5

12

0,5

0,5

0,5

0,5

16

20,0

0,5

0,5

18

Та блица 2

96% гарантированные пределы

Испытуемые сое- Эффективдинения ностb

hpRGF-44-NHz (аналог)

hpGRF (1-44) ОН

hpGRF (1-40) МНz

hpGRF (1-40) ОН

hpGRF (1-37) НН

hpGRF (1-37) ОН

hpGRF (1-34) ОН

hpGRF (1-31)ОН

61

49

28

12

17

50-75

38-62

23-37

23-33

9-16

12-25

6-12

4Для соединения Asn u Gln в данный этап введен 1,136 М избыток 1-оксибензотриазола (HOBt).