Способ определения популяционной принадлежности командорских кальмаров

 

Изобретение относится к рыбному хозяйству, а именно к способам определения видовой принадлежности кальмаров, и может быть использовано для организации рационального промысла и воспроизводства вида. Выделяют оптические ганглии кальмаров, готовят из них водный гомогенат, в него одновременно вводят обратимый ингибитор холинэстеразной активности гомогената с субстратом холинэстеразы и определяют константы ингибирования холинэстеразной активности: K<SB POS="POST">I</SB> - обобщенная, K<SB POS="POST">I</SB> - конкурентная, K<SB POS="POST">I</SB> - бесконкурентная. Для определения популяционной принадлежности командорских кальмаров сопоставляют полученные абсолютные значения констант с ранее известными аналогичных констант для других популяций. В случае их различия делают вывод о том, что исследуемые кальмары относятся к новой популяции, а в случае совпадения значений считают исследуемых кальмаров принадлежащими к известной ранее популяции. 1 ил., 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А 01 К 61/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫ7ИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4326481/30-13 (22) 13. 11. 87 (46) 15. 01. 90. Бюл. Р 2 (71) Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии и Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова (72) Н.Н. Ковалев, Л.М. Эпштейн, Ю.А. Федорец, Г.А. Шевцов, A.Ï. Бресткин, Е.B. Роэенгарт и А.E. Хованских (53) 639.27(088.8) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОПУЛЯЦИОННОЙ ПРИНАДПЕЖНОСТИ КОМАНДОРСКИХ КАЛЬМАРОВ (57) Изобретение относится к рыбному хозяйству, а именно к способам определения видовой принадлежности кальмаров, и может быть использовано для организации рационального промысла

Изобретение относится к рыбному ,хозяйству, а именно к способам определения видовой принадлежности кальмаров, и мает быть использовано для организации рационального промысла и воспроизводства вида.

Способ осуществляют следующим образом, Готовят гомогенат зрительных ганглиев кальмаров, растворы субстрата и ингибиторов. Определяют начальную скорость гидролиза субстрата под действием фермента холинэстеразы (ХЭ) водного раствора гомогената оптических ,ганглиев кальмара, определяют скорость.

„„SU„„1535503 А1

2 и воспроизводства вида. Выделяют оптические ганглии кальмаров, готовят из них водный гомогенат, в него одновременно вводят обратимый ингибитор холинэстеразной активности гомогената с субстратом холинэстеразы и определяют константы ингибирования холинМ эстеразной активности: К; — обобщенI ная, К, — конкурентная, К, — бесконкурентная. Для определения популяйиояной принадлежности командорских кальмаров сопоставляют полученные абсолютные значения констант с ранее известными аналогичных констант для других популяций. В случае их различия делают вывод о том, что исследуемые кальмары относятся к новой популяции, а в случае совпадения значений считают исследуемых кальмаров принадлежащих к известной. ранее популяции. 1 ил., 4 табл. гидролиза субстрата под действием фермента ХЭ ганглиев в присутствии ингибитора обратимого действия, причем «© вводят его одновременно с субстратом, после чего определяют остаточную активность в интервале концентраций субстрата 2 10 -2 10 М, а определение таксономической принадлежности р кальмаров проводят, сопоставляя абсолютные значения конкурентной константы К;, бесконкурентной константы К ., обобщенной ингибированной константы К; и типа торможения с ранее полученными показателями, при этом в случае их различия делают вывод о том, i535503 о I

МОа 20

COoH

02

НООС в 0,2 И фосфатном буфере; растворы ингибиторов: в концентрации 2 10 M и бис(диметил-триметиламмонийметилсилин)этандихлорид

СН3 сн

1 1 (СН 1 Н СИ 5 CH -СН 3> 1С(5)1 2 сн, сн, 30 амидный аналог ацетилхолина сн,с(О)кнсн,сн р(сн,) пиперазиновое производное ацетилхолина сн — сн

C H С(0) IV (ccHH31 3

ЬН1-СИ1 йодметилат лупинина

40

C,Í сульфометилат диэ тилметилсульфонил

Н С вЂ” 5- С Н Снэ50g

1 сн>

Определяют начаЛьную скорость

50 гндролиэа тио-субстрата под действи-" ем фермента холинэстеразы (ХЭ) водного раствора гомогената оптических ганглиев кальмара при рН 7,5, для чего в термостатируемую кювету (t

25 С) вносят последовательно:

0,5 мл 0,87-ный раствор ДНТБ, О, 1 мл

2 10 И ATX и 0,1 мл 3 мг/мл водного что исследуемые кальмары относятся к новой популяции, а в случае совпадения значений считают исследуемых кальмаров принадлежащими к известной ранее по п ул яции.

Пример. Готовят водный гомогенат оптических ганглиев командорского кальмара (3 мг/мл) иэ разных частей видового ареала: Центральные

Курилы, Олюторо-, Наваринского и Прибылово-Аляскинского. Готовят следующие растворы: раствор тио-субстрата-ацетилтиохолинйодида (АТХ)

СН С(О) БНСН. СН N (СН >) g J, в концент-15

3 1 2 рации 2 .10- М 2- 10 M" 0,8X-ный раствор 5,5-дитиобис-(2-нитробенэойная кислота) (ДТНБ). гомогената фермента и 1,2 мл дистиллированной воды до общего объема пробы 2 мл.

Аналогичным образом определяют величину начальной скорости гидролизона субстрата при других его концентра циях, внося в пробу О, 4 мл 2 ° 10 з

АТХ; 0,2 мл 2 10 АТХ; 0 125 мп 2 10

АТХ и 0,1 мл 2 10 АТХ.

Величины начальной скорости гидролиза субстрата рассчитывают по

r3 E формуле Ч вЂ” (1), где Š— изменение экстинции при 412 нм, t — время в секундах.

Рассчитывают обратные величины концентраций субстрата (1/55)) и соответствующих им скоростей реакции (1/Ч) и строят график зависимости двойных обратных величин: 1/Ч от

1/)S) (чертеж, прямая 1).

Далее определяют величину начальной скорости гидролиэа субстрата под действием ХЭ в присутствии ингибитора, для чего в кювету вносят последовательно: 0,5 мл 0,87.-ного раствора ДТНБ; 0,2 мл 2 10 АТХ;

0,5 мл 2 ° 10 М раствора ингибитора;

0,1 мл 3 мг/мл водного гомогената и

0,7 мл дистиллированной воды д6 общего объема пробы 2 мл.

Определяют величину скорости гидролиэа субстрата в присутствии ингибитора по формуле (1).

Аналогичным образом в присутствии ингибитора (0,5 мл 2 10 М) определяется величина скорости реакции при концентрации субстрата 0,4 мл 2 10

АТК; О, 2 мл 2 -10 ATX; О, 125 мл

2 -10 АТХ и 0,1 мл 2 10 эАТХ.

Расччитывают аналогично обратимые величины концентраций субстрата

1/tS ) и величины скорости реакции

1/V и строят график двойных обратимых величин (чертеж, прямая 2).

Далее проводится расчет обобщенной ингибиторной константы.

Расчет константы проводят графическим способом. Находят точку пересечения кривой 1 с осью абсцисс и осью ординат. Отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, равен обратному зна1 чению константы Михаэлиса (-„- — ), а отрезок, отсекаемый на оси орди1 нат есть

1535503

Откладывают отрезок, равный

Km на оси абсцисс в сторону положительных величин, находят точки пересечения этой величины с прямыми 1 и 2 и находят значения проекции этих точек на оси ординат. Отрезок, отсекаемый на оси ординат проекцией с кривой

1 1 10

1 — равен —, а с кривой 2 равен—

Ve i V( (I)—

К; (2)

Ч V, - концентрация ингибитора в пробе (подбирается с таким расчетом, чтобы снижение активности фермента составляло около 50X);

1/V — обратная величина максимальной скорости гидролиза суб- 25 страта в отсутствии ингибитора;

1/Ч. — величина обратного значения максимальной скорости гидролиза в присутствии ингибито- З0 ра;

1/V — величина обратного значения скорости гидролиза субстрата при его концентрации, численно равной значению

К

35 ь

1/Ч. — величина обратного значения

1 скорости гидролиэа субстрата при его концентрации, численно равной К, в при- 4 сутствии ингибитора.

Проводят расчет конкурентной К. и

1 бесконкурентной К . констант ингибироi вания при смешанном типе торможения.

Расчет констант К . и К . проводят

1 1 по калибровочному графику по форму.лам:

15 где { I )

L»

О

Значение величины 1/V гидролиза субстрата при различных его концентрациях (1/(Я )) беэ ингибитора (KI )

О) и в присутствии ингибитора

45 (CI) = 6 5 -10 М) приведены в табл.2.

-ь

Иэ табл. 2 видно, что значение рК. для ХЭ кальмара иэ Олюторо-Нава1 ринского района и ингибитора 1 достоверно отличается от значений рК для

5р ХЭ иэ двух других районов для этого ингибитора.

Достоверны также различия ХЭ кальмара из Олюторо-Наваринского района от ХЭ иэ двух других районов по ве55 личина рК и РК, В то же время ХЭ кальмара из района Центральных Курил и Прибылово-Аляскинского района не различаются по величине рК;, рК, и типу торможения. В данном случае

1 1

У ; V; (3) К.

Vo

Ч; — 1

v.

К.

1 (4) Обобщенную ингнбиторную константу К. рассчитывают по формуле:

Для удобства сравнения констант рассчитывают отрицательные десятичные логарифмы констант pKi, рК

1 и рК,, где рК, .° = -1gK; и т.д.

По соотношению величин констант

I рК. и рК, определяют тип торможения; конкуретйьп (К) (рК .- О), смешанный (С) рК,. - pK; (1, смешанно-конкурентный (С вЂ” К) (р К вЂ” рК .7 1), неконкуретный (Н) рК. = рК . и некон1 курентно-бесконкурентный (Н - Б) рК > рК1).

Значение величин скорости гидролиэа субстрата (V ° 10 М) без ингибитора ((I l = 0) и в присутствии ингибитора ((I)= 6,5 1(T М) при различных его концентрациях ((S)) приведены в табл.1 °

Популяционную принадлежность кальмаров на основании табл. 1 проводят следующим образом.

Проводят сравнение величин фК; для ХЭ кальмаров из трех частей видового ареала, полученные при их взаимодействии с ингибитором 1. Из табл.

1 видно, что величина рК. у ХЭ кальмара из Олюторо-Наваринского района значительно превышает значение рК, для ХЭ кальмара из других двух районов обитания.

В табл. 2 представлены критерии различия при сравнении ХЭ ткани оптическик ганглиев командорского кальмара из трех частей видового ареала. Если значение различия превышает критерий Стьюдента, равный

5,84, то такие различия считаются достоверными.

1535503 достоверные различия наблюдаются

I только по величине рК,, Все перечисленные различия (как по величинам констант, так и по типу торможения) позволяют сделать вывод о различиях в свойствах ХЭ командорского кальмара из трех частей видового ареала, что говорит о существовании нескольких популяций этого вида кальмара в северо-западной части Тихого океана. Анализ его популяционной структуры позволяет дать рекомендации по рациональному вылову командорского кальмара, чтобы не допустить полного изъятия отдельных его популяций, которые имеют вид внутривидовых группировок.

Данный способ определения tBKco номии может быть использован и для других видов кальмара, так как использованные характеристики процесса обратимого торможения являются индивидуальными характеристиками каждой исследованной ХЭ и могут быть использованы для установления популяционной структуры других видо кальма.ров, где это не позволяет установить традиционными методами.

Константы обратимого торможения

М мин скорости взаимодействия обратимых ингибиторов с холинэстеразой оптических ганглиев командорского кальмара из различных частей ареала приведены в табл. 3

Критерии различия при сравнении холинэстераз ткани оптических ганглиев кольмара трех районов ареала (критерий Стьюдента равен 5,84) представлен в табл. 4.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ определения популяционной принадлежности командорских кальмаТаблица 1

I t

25 (8) при C»= 0 при ГТ1= 6,5 10 М

1 10 5 21

1 0-4

30 2 10 429

1,25 10 3,83

110 3,57

4,46

3,92

3,19

2,64

2,37

Таблица 2

I CS1 приГ 3 = 0 при (I)= 6,5.10 М

1000 ,0

10000

19,2

20,8

23,3

26,1

28,0

22,4

25,5

31,3

37,9

42,2 ров, характеризующийся тем, что выделяют оптические ганглии кальмаров, готовят из них водный гомогенат, 5 в него одновременно вводят обратимый ингибитор холинэстераэной активносI ти гомогената с субстратом холинэстеразы и определяют константы ингибирования холинэстераэной актив10 ности: К вЂ” обобщенная К вЂ” конку1 Э рентная, К, — бесконкурентная, а для определения популяционной принадлежности командорских кальмаров сопос тавляют полученные абсолютные значения констант с ранее известными анаi5 логичных констант для других популяций, при этом в случае их различия делают вывод о том, что исследуемые кальмары относятся к новой популяции, а в случае совпадения значений считают исследуемых кальмаров принадлежащих к известной ранее популяции.

1535503

Таблица 3

Олвторо-Наварински

Формула изобретения

Прибылово-Aляскинский

Центральные Кур рК; pK, pR; Т рК; рК рК; Т/Т рК; рК рК; Т/Т Д Г

1 3,9 3,85 (Сн ) МСН З вЂ” Сн н(Снз) . 1Сф сн, 4,43 .С 34,4 3,39 2,26 С-К

2 сн с(о1мнсн,снуем(сн,1,1 2,46 2,33 1,88 с 3,51 3,37 2,93 с 2,96 2,26 2,86 н-В сн,-сн .

42 1 75 2 ° 31

СН,-Сн, Н-Б 2,18 1,43 2,09 Н-Б 3,38 3,22 2,88 С

5,25 5, 16 4,23 С 3,07 3,07 — K 5,32 5,09 4,94 Н

Си9

4g

I сн) С-К 2,98 2 98 - K 2,74 2,74 — K

3,77 3,73 2,65

П р и м е ч а н и е: pK, -18K,. н т.д.; т/т - тип тормонения.

Таблиц а 4

Олюторо-Наваринский н Прнбылово-Алясхинский

1 1

Курилы и Олоторо-Навар скнй район.

Ф ингиби тора

Курилы и Прибылово-Аляс кинский район

Г 3 рк,.

pK. pK< рК рК рК рК рК> рК

I 24,24 29,79 6,52

II 15,43 12,49 16,27

4,69

4,77

6,98

13,03

18 25 17,62

4, 77 11,87

16, 26

18,74

4,4

1>04

2,08

2,22 5,0

34,86

34,1

101,98

37,5

4,66

9,29

3,5

28,58

32,04 см он

4 ф ly

5,47

125,31

51,72

28,09

79,55

7,59

12,84

84,86

7,59

1535503

/ST

Составитель О. Кориенко

Техред М.Дидьк Корректор С. Черни

Редактор И. Сегляник

Заказ 65 Тирам 438 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,!01