Штамм культивируемых клеток китайского хомячка - продуцент эритропоэтина человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и биологии. Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса получения эритропоэтина человека. Штамм получен методом введения клонированного гена эритропоэтина в клетки перевиваемой линии яичника китайского хомячка CHOTK. Штамм обладает высокой и стабильной продукцией эритропоэтина, простотой культивирования и высокой пролиферативной активностью при использовании отечественных сред и сыворотки, может быть использован для промышленного получения эритропоэтина человека.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

И=СПУБЛИЙ (51) 5 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A BTGPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbfTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4394247/30-13 (22) 17 ° 03.88 (46) 07.04.90. Бюл. Ф 13 (71) Научно-исследовательский институт биомедицинской технологии (72) M.Ã.Çåëåíèí, И,А.Крамерова, С,Л.Колобков, Н.С.Филякина и Б.Б.Егоров (53) 577.2/048(088.8) (56) В1оо-с1, 1987, v. 69, р. 1485, (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК КИТАЙСКОГО ХОМЯЧКА — ПРОДУЦЕНТ ЭРИТРОПОЭТИНА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к промышленному производству эритропоэтина человека, который может быть использован для лечебных и исследовательских целей в медицине и биологии .

Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса получения эритропоэтина человека за счет повышения стабильности продукции эритропоэтина штаммом при крупномасштабном культивировании на отечественных микроносителях.

Пример 1. Получение, штамма, Библиотеку генов человека, клонированных в векторе Ch4A, высевают на чашки Петри диаметром 15 см. После переноса фаговых бляшек на нитроцеллюлозные фильтры, амплификации и обработки фильтров по стандартной методике проводят их гибридизацию с 17„„SU„, 1555359 А1

2 медицине и биологии. Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса полуумения эритропоэтина человека. Штамм получен методом введения клонированного гена эритропоэтина в клетки перевиваемой линии яични1 ка китайского хомячка СНОй„. Штамм обладает высокой и стабильной продукцией зритропоэтина, простотой культивирования и высокой пролиферативной активностью при использовании отечественных сред и сыворотки, может быть использован для промышленного получения эритропоэтина чело, века. членными олигонуклеотидами, меченными по 5 концу с помощью P АТФ и поз линуклеотидкиназы. 17-членные олигонуклеотиды синтезируют на основании известной нуклеотидной последовательности гена эритропоэтина человека.

Из ДНК рекомбинантного фага Е 7-2-1 выделяют HindIII BglII фрагмент длиной 3 т,п,н,, содержащий полный ген эритропоэтина человека, и по сайтам

HindIII-BamHI клонируют в вектор экс:прессии pSV2gpt.

Рекомбинантную плазмиду pSVEpol вводят в клетки CHOtk стандартным методом кальцийМосфатной преципитации и проводят селекцию трансфектантов в среде, содержащей гипоксантинаминоптерин-тимидин (ГАТ), Отобранные клетки клонируют методом конечных разведений в присутствии ГАТ. Выделенные клоны культивируют в среде Игла-199

1555359 лено, что плазмида pSVFpo интегрирована в геном этих клеток.

1цтамм клеток, обозначенный CHO Еро 1 характеризуется следующими признаками. l5

Морфологические признаки. Под фазовоконтрастным и световым микроскопами культура представлена монослоем эпителио-.и фибробластоподобных клеток с овальными ядрами, содержащими мелкие ядрышки. По мере увеличения плотности слоя клетки уменьшаются в размерах и приобретают сферическую форму.

Культуральные свойства. Штамм

СНО Еро,1 поддерживается .на отечественных средах Игла-199 (в отношении

1:1) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в виде монослойной культуры, Отделение клеток от стекла или пластика проводят смесью

0,25Х-ного раствора трипсина и 0,02%— ного раствора версена (1:1О), кратность рассева I:6-1:8, посевная доза

2х10 -ЗхlО клеток на 1 см площади сосуда. Плотного монослоя культура достигает к 4-му дню после пассажа.

Криоконсервация. Криоконсервирова-: ние проводят на среде Игла-199 (1:1) с 20Х сыворотки крупного рогатого скота и 7% диметилсульфоксида в качестве криопротектора. Концентрация клеток 2-Зх10 в 1 мл. Жизнеспособными после восстановления остаются 75+5% клеток. 45

Кариологическая характеристика.

Кариологический анализ штамма СНОЕро 1 проводят на 18 и 32 пассажах, Модальный класс клеточной линии онределен подсчетом числа хромосом в 100 метафазных пластинках, Распределение клеток по числу хромосом следующее:

35 хромосом- — 8 клеток, 36 хромосом—

32 клетки, 37 хромосом — 52 клетки, 38 хромосом — 8 клеток °

55

Контаминация. При обследовании.. клеток штамма на с те риль ность (нали« чие бактерий, грибок микоплаэм) цо(l:1) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Секретируемый клетками эритропоэтин тестируют методом включения Н-тимидина в спленоциты анемических мышей.

Таким образом, отбирают клон СЙО Еро клетки которого стабильно продуцируют эритропоэтин в культуральную среду. Методом блот-гибридизации установ-10 лучают отрицательные результаты на. уровнях 10 и.34 пассажеи. i:

Продукцин1 эритропоэтина клетками штамма СНО Еро 1 тестируют методом включения Н-тимидина мышиными эритробластами: и методом стимуляции об> разования эритроидных колоний при культивировании клеток костного мозга в метилцеллюлозе. Максимальный уровень продукции эритропоэтина клетками штамма СНО Еро l достигается на

4-е сутки культивирования и составляет 1-2 ед на 1 мл культуральной cpgды.

Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) У 162 О.

Пример 2. Культивирование штамма СНО Еро 1 в ферментере на микроносителях цитолар-1 и цитодекс-3, 10 клеток штамма СНО Еро 1 в 1 мл

5 помещают в среду роста, содержащую микроносители с суммарной площадью

7 см /мл среди. 100 мл этой среды г заливают во флакон емкостью 300 мл с подвесным эксцентричным магнитом, Посадка клеток на носитель осуществляется в течение 4 ч в прерывистом режиме (перемешивание 5 мин, пауза

25 мин при скорости вращения 30 об/миндI

В дальнейшем культивирование проводят при непрерывном перемешивании при скорости вращения 30 об/мин, В течение 6 дней концентрация клеI а ток возрастает до lх10 клеток на

1 мл среды. Через каждые 12 ч проводят отбор проб. Концентрацию эритроцоэтина определяют также, как в примере 1.

Культивирование штамма СНОЕро l на микроносителях цитолар-1 и цитодекс-3 дало одинаковые результаты, Таким образом, штамм-продуцент адаптирован к отечественной ростовой среде и сыворотке крупного рогатого скота, Стабильно продуцирует

5 ед,/мл эритропоэтина при культивировании в матрасах и 10-12 ед./мл при культивировании клеток в роллер" ных бутылках, Клетки линии СНО Ера l адаптированы к микроносителям типа цитолар, что значительно удешевляет производство гормона, 5 1 555359 6

При культивировании в 20 л фермен- Q о р м у л а и з о б р е т е н и я .тере концентрация зритропоэтина до- Штамм культивируемых клеток кистигает 4-6 ед./мл. тайского хомячка ВСКК(П) У 162D— продуцент зритроноэтина человека, Составитель Т,Забойкина

Редактор Н,Рогулич Техреду А.Кравчук Корректор М,Шароши

Заказ 538 Тирам 486 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изрбретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óèãîðîä, ул. Гагарина, 101