Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к группоспецифическому антигену n системы mnss эритроцитов человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического N-антигена в эритроцитах человека. Целью изобретения является удешевление процесса получения моноклональных антител за счет создания нового штамма гибридных клеток животного MUS MUSCULUS, секретирующего моноклональные антитела, специфически выявляющие N-антиген в эритроцитах человека. Штамм получают слиянием мышиной миеломы РЗ-Х63-А. 8.653 с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON под воздействием полиэтиленгликоля М.В.3000 и дальнейшего культивирования в селективной среде ГАТ. Соотношение миеломных клеток и спленоцитов 1:3. Клетки пассивируют каждые 2-3 дня. Секретируемые монАТ на третьи сутки достигают титра 1:64-1:256 (культуральная жидкость) и 1:1600-1:2800 (в асцитной жидкости). Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 255Д. МонАТ могут быть использованы для выявления N - антигена в эритроцитах и других клетках человека. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) э

flPH П.(НТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ пО изОБРетениям и ОтнРытиям

1 (21) 4452305/30-13 (22) 29.06.88 (46) 23.03.90. Бюл. 9 11 (71) Всесоюзный гематологический научный центр (72) Е.И.Дерюгина, Н.И,Дризе, Л.Н.Леменева, E.Þ.Ñàäîâíèêîâà, Г.А.Удалов и И.Л.Чертков (53) 578.085.23(088.8) (56) Fraser R.Н., Munro А.С., Williamson А.R, et al. J. Immunogenetics, 1982, ч. 9, р. 295-301.

Fletcher А., Harbour С. J. Immunogenetics, 1984, ч. 11, р, 121-126, е (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS. MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКОМУ

АНТИ ГЕНУ-N СИСТЕМЫ MNS АРИТРОЦИТОВ

ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического

N-антигена в эритроцитах человека.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического антигена-N в эритроцитах и других клетках человека.

Целью изобретения является удешевление процесса получения моноклональных антител за счет создания нового штамма гибридных клеток животного Mus. musculus секретирующего моноклоналвные антитела (И)НАТ),спе(51)5 С 12 N 5/00 А 61 К 39/395

Целью изобретения является удешевление процесса получения моноклональных антител эа счет создания нового штамма гибридных клеток животного

Mus. muscu1us, секретирующего моноклональные антитела, специфически выявляющие N-антиген в эритроцитах человека ° Штамм получают слиянием мышиной миеломы Р3-X63-Ag 8.653 с клетками селезенки мыши линии BALB/с, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON под воздействием полиэтиленгликоля М.В,3000 и дальнейшего культивирования в селективной среде ГАТ. Соотношение миеломных клеток и спленоцитов 1:3. Клетки пас- а сируют каждые 2-3 дня. Секретируемые е

MOHAT на третьи сутки достигают титра 1:64-1:256 (культуральная жидкость) и 1:1600-1:12800 (в асцитной жидкости). Штамм депонирован под номером

ВСКК(П) 1(2550. МОНАТ могут быть использованы для выявления N-антигена в эритроцитах и других клетках человека. 1 табл. цифически выявляющие N-антиген в эритроцитах и клетках тканей человека °

Штамм получают следующим образом.

Штамм перевиваемых гибридных клеток мыши Mus. musculus N-86/2 получают в результате слияния мьш иной миеломы РЗ-Х63 Ag 8.653 с клетками селезенки мышей линии BALB/с, иммунизированных эритроцитами человека фе,нотипа ON, под воздействием полиэтиленгликоля мол,мас. 3000 и дальнейше1551739

10 го культивирования в селективной среде ГАТ. При слиянии используют соотношение миеломных клеток и спленоцитов 1:3 при oCmeM количестве миелом6 ных клеток 160 10 и клеток селезенки

450 10 . После слияния клетки куль6 тивируют из расчета 2 10 спленоци5 тов на ячейку 96-луночной плоскодонной платы. Эффективность гибридизации

79Х, Штамм получают в результате 4кратного клонирования методом лимитирующих разведений при 100Х антителообразующих клонов в двух последних клонированиях.

Штамм N-86/2 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий позвоночных под номером ВСКК(П) Р 255D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные характеристики.

Стационарная суспензионная культура клеток в жидкой среде содержит (3-4) 10 клеток/мл. Рассаживание

1:2-1:3 через 2-3 сут ° Клонирование осуществляют на перитонеальньм макрофагах мыши. Среда для культивирования: ДРЕМ, 20Х эмбриональной телячьей или оленьей сыворотки, 4 мМ Еглнтамина, 2 мИ пирувата натрия, 20 мМ НЕРЕЯ-буфера, 5 10 М 2-меркаптоэтанола, 10 среды, концидиони6 рованной спленоцитами мыши (4.10 /мл в полной питательной среде, 10 сут) и антибиотики, 37 С, 95-100Х влажности, 6Х СО в воздухе.

Культивирование гибридных клеток в организме животного: мыши линии

BALB/с или их F<-гибриды с мышами линий WR или DBA/2; пристан по

0,25 мл в/бр за 7-30 сут до введения клеток по (2-5) 10 на мышь. Сред6 нее время роста гибридомы в форме асцитной опухоли 12 сут, Морфология клеток: штамм представ— лен слабоприкреплякщимися к субстрату клетками с обычной для антителообразующих гибридных клеток морфологией.

Видовая принадлежность штамма доказана цитогенетическим методом. Кариотип соответствует виду Mus. musculus. Число хромосом составляет 81-90, генетические маркеры 2 большие метацентрические хромссомы.

Продуктивность штамма. Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом: анти-N антитела, агглютинирунудие эритроциты человека, 15

55 содержащие N-антиген. Метод тестирования — агглютинация в солевой среде или на плоскости.

Характеристика биосинтеза полезных продуктов: титр антител в культуральной жидкости в реакции солевой агглютинации в круглодонных микроплатах 1:64-1:256, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации на плоскости 1:1600-1:12800. Стабильность антителопродукции сохраняется в течение 13 пассажей в культуре и 2 пассажей в мыши.

Криоконсервирование клеток. Ростовая среда, IO . ДМСО, 40Х любой сыо воротки, сутки при -70 С, затем— жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания по трипановому синему

56 .. После размораживания культивирования ведут в 24-ячеечных платах по 0,5.10 клеток в ячейку на фидере

6 из перитонеальных макрофагов мыши (2.10з/ячейку).

Контаминация. Не обнаружена бактериями, грибами и микоплазмами. Вирусы не тестированы.

Пример, Активность в серологических реакциях.

Образцы индуцированной клетками штамма N-86/2 асцитной жидкости мышей исследуют по известным методам со стандартными эритроцитами в реакции агглютинации на плоскости и в реакции агглютинации в солевой среде в 96-луночных микроплатах. Под титром антител подразумевают такое их последнее разведение, при котором в ячейке микроплаты наблндан т агрегаты эритроцитов, а на плоскости крупные аггЬютинаты начинают образовываться не позднее 2 мин. Под авидностью антител подразумевают сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое в реакции агглютинации на плоскости по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реакции агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр).

Результаты исследования титра (активности) и авидности МОНАТ, секретируемых клетками штамма N-86/2 и направленных к антигену-N системы

MNSs эритроцитов человека, представлены в таблице, Результаты, приведенные в таблице, показывают, что YOHAT N-86/2, 1551739

Формула изобретения

Авидность, с, с эритроцитами фенотипа

Титр в реакции агглютинации в солевой среде на плоскости с эритроцитами фенотипа

Разведение

Антитела

ы 1 м 1 ы

N М

Гетероиммунная сыворотка (119)

MOHAT N-86/2 культуральная жидкость

2

МОНАТ N-86/2 асцитная жидкость

17-35-58 (-)

1:16- 1:2

1:32

1:2 0

1:32 1:2

1:64 1:4

Не определяли

I 256 1:16 1:256 1:32 0-1-3 6-13-21

Не определяли Не определяли 11-17-26 93-(-)

1:16 1:2 1:64 1:8 3-5-7 10-14-22

Не определяли Не определяли 14-39-59 (-) 1:100

1:5000

1:100

1:3200

Ф (-) — параметр реакции агглютинации не достигнут в течение 2 мин.

Составитель А.Маныкин

Редактор Н,Рогулич Техред М.Дидык Корректор Т.Уалец

Заказ 309 Тираж 498 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г.ужгород, ул. Гагарина, 101 как и поликлональные антитела гетероиммунной кроличьей антисыворотки, обладают условной специфичностью, т.е. преимущественно реагируют с эритроцитами фенотипа N, но вызы5 вают положительную реакцию агглютинации (в меньшем титре) при исследовании эритроцитов фенотипа М. И в том, и в другом случае перекрестная активность с М эритроцитами обусловлена наличием N-подобной детерминанты в молекуле гликофорина В, экспрессированного как íà M так и на

И-эритроцитах. В связи с этим, получение специфических гетероиммунных анти-N антисыворотки требует интенсивной абсорбции реагента эритроцитами, не содержащими N-антиген, а получение специфичного моноклонального анти-N реагента требует лишь разведения исходного продукта до тех значений, при которых реакция агглютинации с М-эритроцитами отсутствует в течение определенного, заранее обо- 25 эначенного времени (2 мин).

Таким образом, МОНАТ, секретируемые штаммом N-86/2 в асцитной форме, позволяют путем разведения асцитной жидкости в 1000-5000 pas иметь высокоактнвный стандартный реагент анти-N для выявления N-антигена в эритроцитах и других клетках человека. Получение анти-N моноклонального реагента на основе МОНАТ, продуцнруемых перививаемыми гибридными клетками штамма N-86/2 в брюшинной полости мьппи, менее трудоемко, чем получение гетероиммунной кроличьей сыворотки, не требует дополнительной абсорбции эритроцитами и дает более стандартные результаты.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus ВСКК(П)

II 255D, используемый для получения моноклональных антител к группоспецифическому N-антигену системы MNS эритроцитов человека.