Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной форме н-антигена человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS - продуцента высокоактивных и высокоспецифичных моноклональных антител (МонАТ) для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека. Штамм получают слиянием мышиной миеломы Рз-Х63-Ад8653 с клетками селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Депонирован под номером ВСКК(П) N 253Д. Клетки культивируют в среде PPMJ 1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Частота пассивирования 2-3 сут

кратность рассева 1:3-1:4. Стабильная продукция МонАТ наблюдается в течение 2 пассажей на мышах, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в солевой среде с эритроцитами фенотипа 0 составляет 1:256-1:512 тыс., в культуральной 1:256-1:512. МонАТ относятся к классу 1дМ, они специфичны для Н-антигена в эритроцитах человека. МонАТ могут быть использованы в диагностических целях. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСЛУБЛИК (19) (ll) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4452142/30-13 (22) 29.06.88 (46) 23.03.90. Бюл. Р 1) (7l) Всесоюзный гематологический научный центр (72) Й.И.Дерюгина, Н,И.Дризе, Л.Н.Леменева, Е.Y..Ñàäîâíèêîâà, Г.А.Удалов, И.Л.Чертков, М.И.Лапенков и А.E.Íîñûðåâ (53) 578.085.23(088.8) (56) Наставление по применению гетероиммунной анти-Н козьей сыворотки диагностической жидкой для судебномедицинских целей. М3 СССР. Утв.

20.06.74.

Патент ГДР М 241852, кл. А 61 К 39/395, С 12 N 5/02, 1987, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК NHBOTHblX MUS MUSCULUSi ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ ФОРМЕ Н-АНТИГЕНА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека. Целью изобИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животного Mus. musculus продуцента высокоактивных и высокоспецифичных моноклональных антител (51) 5 С 12 N 5/00 А 61 К 39/395

2 ретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus — продуцента высокоактивных и высокоспецифичных моноклональных антител (МОНАТ) для выявления мембраносвязанной формы Нантигена человека. Штамм получают слиянием мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag8653 с клетками селезенки мышей линии

BALB/с, нммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Депонирован под номером ВСКК(П) М 253D. Клетки культивируют в среде RPMI 1640 с 20Х эмбриональной телячьей сыворотки.

Частота пассирования 2-3 сут: кратность рассева 1:3-1:4. Стабильная продукция МОНАТ наблюдается в течение 2 пассажей на мьшах, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в солевой среде с эритроцитами фенотипа 0 составляет

1:256-1:512 тыс., в культуральной

1:256-1:512. МОНАТ относятся к классу 1 gM, они специфичны для Н-антигена в эритроцитах человека. MOHAT могут быть использованы в диагностических целях. 2 табл.

I (MOHAT) для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека.

Штамм перевиваемых гибридных клеток мыши Mus. щизси1цз H-86/50 получают в результате слияния мьшиной миеломы РЗ-Х63 Ag8.653 с клетками селезенки мышей линии BALB/с, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. При слиянии используют

1551738 полиэтиленгликоль мол. мас. 3000, соотношение миеломных клеток и спленоцитов было 1:3 при общем количестве

6 спленоцитов и клеток миеломы 450.10 и 160 10 соответственно. Селекцию неслившихся миеломных клеток проводят в среде, содержащей аминоптерин (НАТ-среда).

Штамм получен в результате 3-крат- lp ного клонирования методом лимитирующих разведений при 100 антителообразующих клеток в двух последних клонированиях.

Штамм H-86 /50 хранится в коллек- 15 ции перевиваемых клеточных линий позвоночных под номером ВСКК(П) Н" 253D и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культу- 20 ра состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату клеток с обычной для гибридных антителообразующих клеток морфологией.

Кариологические признаки, Карио- 25 тип соответствует Mus. musculus.Модельное число хромосом 93 с интервалом варьирования 87-94 ° С помощью С окрашивания выявляются большой и малый метацентрики и один большой акроцентрик.

Культуральные признаки. Среда для культивирования RPMI 1640 или ДМЕМ с 20/ эмбриональной телячьей сыворотки, 4 MY L-глютамина, l цирувата натрия, 2X HEPES-буФера, 5 10 2-меркаптоэтанола, антибиотики. Характер роста — стационарная суспензия. Me— тод снятия — резиновым "полисменом".

Частота пассирования 2-3 сут. Крат- 40 ность рассева 1:3-1:4.

При введении мышам BALB/ñ предварительно обработанным пристаном (2-5) 10 клеток асцит образуется

6 через 9 — 14 сут. Стабильная продукция 45 антител наблюдается в течение 2 пассажей на мышах, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в солевой среде с эритроцитами фенотипа 0 составляет 1:256-1:512 тыс,50 в культуральной 1:256-1:512.

Характеристика MOHAT. MOHAT продуцируемые штаммом H-86/50, выявляют

Н-антиген, связанный с мембраной эритроцитов в реакциях агглютинации на плоскости и солевой среде и реакции абсорбции-элюпии с образцами, содержащими эритропитьi c kl-антигеном.

MOHAT H-86/50 принадлежат к классу 1 gM.

Консервация клеток. Ерио защитная среда: 50 . среды, 40 . сыворотки, 10 : ДМCO.

Режим замораживания. Клетки в криозащитной среде помещают на сутки при о

-70 С, после чего переносят в жидкий азот, Выживаемость клеток при размораживании составляет 70-85 . от жизнеспособных клеток до замораживания.

Сведения о контаминации линии, Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружены. Вирусы «е тестированы.

Пример. Лктивность MOHAT

H-86/50 в серологических реакциях.

Образцы индуцированной клетками штамма асцитной и кондиционированной культуральной жидкостей исследовали по известным в серологии методам.

Титр и авидность антител определяли в реакции агглютинации на плоскости или в солевой среде (титр) в

96-ячеечных микроплатах. Под титром антител в реакции на плоскости или солевой среде подразумевали такое последнее их разведение, при котором крупные агглютинаты на плоскости начинали образовываться не позднее

30 с, а в ячейке наблюдали агрегаты эритроцитов. Под авидностью антител подразумевали сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое в реакции агглютинации на плоскости с эритроцитами фенотипа 0 по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реакции агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр).

Титр и авидность анти-Н антител в реакции агглютинации на плоскости приведены в табл. 1, а титр в реакции агглютинации в солевой среде — в табл. 2.

Результаты, приведенные в табл.1 и 2, показывают, что МОНАТ H-86/50 как в культуральной жидкости, так и в реагенте, приготовленном путем разведения асцитной жидкости в 100 раз

0,3 М раствором хлористого натрия по отношению к эритроцитам фенотипа О, обладают гораздо более высокими титрами и авндностью по сравнению с гетероиммунными козьими анти-Н антисыворотками.

5 1551738

Т а б л и ц а

11родолжение табл. 2

Титр Авидность, с

Разведение

Антитела анти-Н

1:256-1:512

I:256

1:2 7-13-19

1:256

I:128-1:256

4-7-10

1-2-3

Таблица 2

Титр

Серия, уо

Антитела анти-H

Формула изобретения

Гетероиммунная сыворотка

20 1:2-1 3

108 I:2-1:4

79 l:4-1:8

Составитель А.1 аныкин

Редактор H.Ðîãóëè÷ Техред М.Дидык Корректор С.Черни

Тираж 500

Заказ 309 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул . Гагарина, 101

Гетероиммунная сыворотка, с.20

МОНАТ культуральная жидкость I:8

Н-86/50 асцитная жидкость 1:100 I:32

МОНАТ культуральная 1 жидкость 2

П-86/50 асцитная жидкость, разведение I 100 1

С помощьк. моноклонального анти-Н реагента, полученного на основе антител секретируемых гибридомой

H-86/50, можно надежно выявлять Нантиген на эритроцитах и, таким образом, устанавливать присутствие крови в объектах, подлежащих судебномедицинской экспертизе.

25 Штамм гибридных культивируемых клеток животных Nus. musculus ВСКК(П)

li - 253D, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной форме Н-антигена человека.