Способ отбора сортов и линий гороха с высоким содержанием триптофана

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционно-генетическим исследованиям растений, и может использоваться при создании новых сортов гороха. Целью изобретения является ускорение анализа и снижение его трудоемкости. Способ состоит в том, что проводят электрофорез изоферментов зерна гороха и затем выявляют высокотриптофановые генотипы по наличию пероксидаз с относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП) 0,09-0,12 и эстераз с ОЭП 0,67-0,70. 2 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСтИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (gg)q А 01 Н 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4283287/30-13 (22) 21.05.87 (46) 15.04.90. Бюл. Р 14 (71) Научно-производственное объединение по зернобобовым и крупяным культурам "Орел" (72) В.И.Володин, Р.С.Музалевская, В.А.Рыбникова и А,В.Блок (53) 575.224 (088.8) (56) Методы биохимического исследования растений/Под ред. А.M.Eðìàêoва, Л.: Колос, 1972, с. 313.

Изобретение относится к лиотехнологии, в частности к селекции растений, и может быть использовано для созда-: ния сортов с высоким содержанием незаменимых аминокислот, в частности триптофана.

Цель изобретения — ускорение анализа и снижение его трудоемкости.

Способ состоит в том, что оценку растений гороха на повышенное содержание триптофана ведут по наличию пероксидаз с относительной электрофоретической подвижностью 0,09-0, 12 и/или эстераз с относительной элект рофоретической подвижностью 0,670,70.

Способ иллюстрируется следующиьп . примерами.

„.,SU„„3 556598 А 1

2 (54) СПОСОБ ОТБОРА СОРТОВ И ЛИНИЙ

ГОРОХА С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ТРИПТОФАНА (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционногенетическим исследованиям растений, и может использоваться при создании новых сортов гороха. Целью изобретения является ускорение анализа и снижение его трудоемкости. Способ состоит в том, что проводят электрофорез изоферментов зерна гороха и затем выявляют высокотриптофановые генотипы по наличию пероксидаз с отно сительной электрофоретической подвижностью (ОЭП) 0,09-0, 12 и эстераз с (ф

ОЗП 0,67-0,70. 2 табл.

Пример 1. Берут 2г семян гороха сорта Feton. Семена очищают от семенной оболочки и зародыша, размалывают на электрической лабораторной мельнице "Пируэт", обезжиривают.

Навеску муки 200 мг экстрагируют трисцистеиновым буфером в течение 1,5 ч на холоде при постоянном помешивании.

После этого центрифугируют при 8 тыс. об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант используют для электрофоретического исследования изоферментного спектра эстераз и пероксидаз в ПААГе. Злектрофорез проводят на электрофоретическом аппарате фирмы

"Реанал". Трубочки, заполненные полиакриламидным (застывшим) гелем„ закрепляют в электродной камере, вно1556598

Через 10 мин в пробирки с гелем и указанной смесью добавляют по

0,2 мл перекиси водорода (37) и оставляют стоять гели в этой смеси

20 мин, после чего сливают, промывают дис.тиллированной водой и фиксируют 207-ным этиловым спиртом.

После проводят подсчет спектра белковых компонентов (изоформ) пероксидаз и эстераз, используя миллиметровую линейку. Затем вычисляют относительную электрофоретическую подвижность каждого компонента (ОЭП или М) .

S0 сят н них по 1 капле (0,033 мл) супернатанта, 1 капле сахарозы и 1 капле краски (бромфеноловый синий). Буфером для нижней и верхней электрод5 ных камер служит трисглициновый буФер (pH 8,3).

Электрофорез идет в холодильнике в течение 60 мин. Первые 15 мин электрофорез ведут при силе тока 2 мА на трубку, что способствует более равномерному распространению белка по всей поверхности геля. Затем устанав.ливают силу тока 4 мА на гель, По окончании разгонки (белок проходит по всей длине геля в трубочке) гели вынимают .из трубочек, помещают в пробирки и заливают фосфатным буфером рН 6,2, который сливают через 30 мин.

Затем гели заливают на 30 мин смесью> 20 приготовленной следующим образом:

150 мл фосфатного буфера рН 6,2, 300 мг прочного синего, 3 мл Ф-наф" тила, разведенного в 96 этиловом спирте. Эту смесь перед употреблением 25 фильтруют. Слив эту смесь, гели про-мывают дистиллированной водой, а затем фиксируют следующей смесью: 234 мл воды дистиллированной, 60 мл спирта, 6 мл соляной кислоты. После этого проводят подсчет. белковых компонентов (изоформ) эстераз.

Дпя разгонки пероксидаз вначале проводят те же операции, что и при разгонке эстераз. Отличие в том, что после того, как гель вынимают из трубочек, его (гель) заливают на 20 мин буфером рН 4,8, приготовленным из

4,6 мл уксусной кислоты и 16 г уксуснокислого натрия и доведенным pо

1 л дистиллированной водой, Через

20 мин гели заливают смесью, состоящей из 171 мл буфера рН 4,8,9 мл бензидина и 2,4 мл пирокатехина.

Исследование комг онентного состава пероксидаз показывает, что в спектре присутствуют компоненты с относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП или Rf) 0,09, а в спектре эстераз 0,70. Сорт обладает высоким содер. жанием триптофана.

Пример 2. Берут семена гороха сорта KohI .efo, Готовят семена и проводят электрофорез по методике примера 1.

Исследование компонентного состава пероксидаз показывает, что в спектре присутствуют компоненты с ОЭП 0,10, а в спектре эстераз — компоненты с

ОЭП 0,67 „ 0,68 и 0,70. Сорт обладает высоким содержанием триптофана.

Пример 3. Берут семена гороха сорта Горизонт. Готовят семена и проводят электрофорез по методике примера

Исследование компонентного состава показывает, что в спектре пероксидаз присуствуют компоненты с ОЭП 0,06, а в спектре эстераз — компоненты с

ОЭП 0,08. Сорт обладает низким содержанием триптофана.

Пример 4. Берут семена гороха сорта Зерноградский многоплодный.

Семена готовят и проводят электрофорез по методике примера 1. В спектре эстераз присутствуют компоненты с ОЭП 0,07 и О, 11. Сорт обладает низким содержанием триптофана.

Характеристика сортов гороха с различным содержанием триптофана приведена в табл;f и 2.

К образцам с высоким содержанием триптофана относят те, у которых в электрофоретическом спектре пероксидаз имеются компоненты с ОЭП 0,090,12 и(или).эстераз с ОЭП 0,67-0,70, Присутствие всех компонентов необязательно, это может быть один или несколько компонентов, имеющих ОЭП в указанных пределах.

Образцы с низким содержанием триптофана имеют в спектре пероксидаз компоненты. с ОЭП 0,06-0,08 и(или) в спектре эстераз компоненты с ОЭП

0,04-0,12.

Исследование злектрофоретического спектра пероксидаз и эстераз изучаемых сортов показало, что для сортов, обладающих повышенным содержанием триптофана, характрно наличие в спектре пероксидаз компонента с относительной электрофоретической подвиж5

1556598 6 ностью (ОЗП) 0,09-0,12 .(табл.1) и(или) создание нового сорта, снижает трудокомпонента эстераз с ОЭП 0,67-0,70 емкость селекционного процесса. (табл. 2) . Однако, как видно из дан- Формулаизобретения ных табл 1 и 2, необязательно при- Способ отбора сортов и линий госутствие всех компонентов в указанных роха с высоким содержанием триптопределах, в том числе и их граничных фана, включающий анализ и оценку исзначений. следуемых сортов и линий с последующим отбором по интересующему признаНаличие белкового маркера на повыку, отличающийся тем, шенное .содержание триптофана дает воз 19 что, с целью ускорения анализа и сниможность эффективно вести оценку в жения его трудоемкости, анализ ведут питомнике исходного материала (после путем электрофореэа изоферментов и гибридизации, мутагенеза и т.д.), что отбор сортов и линий с высоким сопозволяет выделить ценные генотипы на держанием триптофана осуществляют по ранних этапах селекционного процесса. 15 наличию — них пероксидаз с относиИспользование предлагаемого спосо- тельной электрофоретической подвижба оценки растений гороха на повышен- ностью 0,09-0,12 и/или эстераэ с отное содержание триптофана по срав- носительной электрофоретической -поднению с известным сокращает время íà 20 вижностью 0,67-0,70.

Твблица1

Относнтельнвя электрофоретическая подвнвность

Количество триптофана> мт на 100 г сухого вещества

Сорт

j>,гг

05 .0 06 0 07 0,08

0,13

О, 200

213

222

307

316

337

348

375

Местный Лъвовск. обл.

Горизонт

Пелщщкв местнвя

Грузия

Premier

Зер>гоградск. многопл.

Vares

Frosen

I>ohiefo

0limpie

kuh1a von Gran

GloGhofs Йоа1

Feton

Wan. w. titan

П р и и е ч в н и е. (+) - компонент присутствует, (-) - компонент отсутствует.

Таблица 2

Количества триптсфана, иг на

100 г сухого венества

Сорт

Относительная электрафаретическвя падвиннасть

0,05 0,06 0,07 О, 08 0> 09 О, l0 и>68 О>69 О>70 О> 1

0,03 0,04

0,66 0,67

О, 1l О, 12

0,13

Нестньв1 Льаанск. абл.

Гариэант

11елмнка местная

Груэня

Premier

Зернагралск. мнагапл. уагев

>гавел

Rohiefa

0Iym1>ie

Ruhm von Втап

Ота81га(в Rival

yetап

Jan.>>, z 1 we

0имечан

21О

213

222

ЗО7

316

ЗЗ7

348

355375. р и е. + -ка>еганаит присутствует; - - компонент отсутствует.

Составитель В>Демкин

Редактор М.Недолуженко Техред И.Ходанич Корректор О.Ципле

Заказ 670 Тираж 436 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб>в д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101