Способ выявления микобактерий туберкулеза

 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к лабораторной диагностике туберкулеза животных, и может быть использовано в медицинских и ветеринарных бактериологических лабораториях для обнаружения возбудителя туберкулеза и выделения культуры в чистом виде. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа. Для этого различные патологические материалы подвергают одновременному обогащению флотацией микобактериями туберкулеза парафином (дисками или пленкой) и последующему культивированию микобактериями до получения культуры в чистом виде на поверхности жидкой питательной среды. Дифференциацию туберкулезных микобактерий от нетуберкулезных осуществляют по способности к пигментообразованию и по скорости появления характерного первичного роста на парафиновых дисках и пленке в жидких питательных средах и в субкультурах на яичных питательных средах.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУЬЛИН (Р1) С 12 g 1/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НО14ИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТ. НЯМ

ПРИ ГИНТ ССОР (21) 4293262/30-13

° (22) 03.08.87 (46) 15,04 ° 90. Бюл. N- 14 (71) Воронежский сельскохозяйственный институт им. К,Д. Глинки (72) С.Г. Субботина (53) 576.8.093.1 (088.8) (56) Бюллетень ВИЗВ, в. XXXIV, М, 1879, с. 31 33. (54) СП0С0Б В11 1ВЛЕПИ ИИКОБАКТЕРИЙ

ТУБЕРКУЛЕЗА (57) Изобретение относится к ветеринарии, в частности к лабораторной диагностике туберкулеза животных, и может быть использовано в медицинских и ветеринарных бактериологических лабораториях для обнаружения возбудителя туберкулеза и выделения

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к лабораторной диагностике туберкулеза животных, и может быть использовано в медицинских и ветеринарных бактериологических лабораториях для обнаружения возбудителя туберкулеза и выделения культуры в чистом виде, Цель изобретения — ускорение и упрощение способа.

Пример 1. Исследуемый патологический материал измельчают ножницами и тщательно растирают фарфоровым пестиком со стерильным песком в стерильной фарфоровой ступке, добавляя к нему (в равном объеме) используемую жидкую минеральную или элективнуо питательную среду. Растертый патологический материал фильтруют

„„ЯО„„ I 5573 66

2 культуры в чистом виде. Цель изобретения — ускорение и упрощение способа. Для этого различные патологические материалы подвергают одновременному обогащению флотацией микобактериями туберкулеза парафином (дисками или пленкой) и последующему культивированию микобактериями до получения культуры в чистом виде на поверхности жидкой питательной среды.

Дифференциацию туберкулезных микобактерий от нетуберкулезных осуществляют по способности к пигментообразованию и по скорости появления характерного первичного роста на парафиновых дисках и пленке в жидких питательных средах и в субкультурах на яиччых пи- Й

TaTpJIbHblx средах. через двойной слой стерильной марли в стеклянную коническую колбу (емкостью 50,0 мл) в объеме 5 ил и добав ляют равный объем этой же стерильной жидкой питательной среды. Затем проводят обогащение микобактериями туберкулеза исследуемых патологических материалов флотацией с помощью парафина, который используют одним из приведенных способов.

Первый способ . К полученной смеси питательной среды и исследуемого патологического материала пастеровской пипеткой с баллончиком добавляют по

20-30 капель расплавленного до 5055 С стерильного парафина, которые, о застывая на поверхности смеси, образуют парафиновые диски до 0,5 см, изолированно расположенные один от1557166 носительно другого на поверхности смеси.

Второй способ ° Готовят по прописи минеральную или элективную жидкую питательную среду, разливают ее по

5 мл в стерильные стеклянные колбы, (емкостью 50,0 мл) и в каждую добавляют кусочек парафина (величиной с горошину), затем среду стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин, после остывания которой при комнатной температуре поверхность среды покрыта тонким прозрачным слоем парафина в виде сплошной пленки, под которую добавляют равное количество (5 мл) суспензии растертого в этой же среде стерильной средой исследуемого патологического материала.

После посева патологического материала одним из способов колбу закрывают стерильной ватно-марлевой пробкой и оставляют при комнатной температуре на 60-90 мин для флотации микобактерий туберкулеза парафином .(дисками или пленкой) из суспензия исследуемого патологического материала, находящегося в колбе. По ,истечении указанного срока из колбы бактериологической петлей снимают 1-2 парафиновых диска или кусочек пленки парафина переносят на стерильное предметное стекло и производят легкое втирание, для чего несколько раз проводят нижней поверхностью диска по предметному стеклу нли бактериологической петлей соскабливают микобактерии туберкулеза с нижней поверхности парафинового диска или пленки и гОтовят мазОк егО подсушивают фик 40 сируют над пламенем горелки, окрашивают по Цилю-Нильсену, микроскопируют и изучают морфологию микобактерий до инкубирования. Независимо от результатов микроскопии колбу"с парафиновы45 ми дисками или пленкой ставят в тер- . мостат при 37,5-38,5ОС для выращивания микобактерий и ежедневно проверя,ют .появление первичного роста микобактерий туберкулеза, для чего наблюдают за формированием колоний, который независимо от вида микобакте" рий легко обнаруживаются невооруженным глазом на нижней поверхности и краях парафиновых дисков или пленки в течение 1 — 3 — 7 — 10 дней в виде мелких, круглых от бледно-желтого до грязно-серого цвета изолированных колоний, обильно покрывающих нижнюю поверхность парафиновых дисков или пленки. В этот период нижняя поверхность парафиновых дисков или пленки как бы посыпана манной крупой. К

3 — 5 — 7 - 10 дню (срок зависит от уровня микобактериальной обсеменности используемых патологических материалов) инкубировайия колоний микобактерии увеличиваются в размерах и покрывают нижнюю поверхность дисков или пленки сплошным налетом, а по краям дисков или пленки образуют сплошной "ободок", выступающий на поверхности дисков или пленки. В эти же сроки формируется между дисками вначале прозрачная пленка, хорошо обнаруживаемая и не разбивающаяся при легком встряхивании колбы, при этом все диски объединены ею и представляют монолитную массу, полностью покрывающую поверхность питательной среды в колбе.

В мазках, изготовленных с дисков или кусочков пленки парафина и окрашенных по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза в этот период фи-зиологически молоды, хороша и равномерно окрашиваются, имеют типичную морфологию.В мазках, изготовленных из прозрачной пленки, микобактерии мелкие, имеют коккообразную форму, окрашиваются равномерно.

К 5-10 дню пленка между дисками становится стеориноподобной, морщинистой, хорошо различимой, а позднее — мощной, выступающей над поверхностью дисков, окраска ее идентична цвету колоний на диске. На парафиновых дисках или пленке парафина в эти сроки накапливается значительное количество бактериальной массы и виде толстого слоя. На мазках, изготовленных с дисков и пленки парафина и окрашенных по Цилю-Нильсену, микобактерии имеют типичную морфологию, хорошо окрашиваются.

Такая последовательность характера роста типична для всех видов микобактерий, при этом скорость появления первичного роста и количество накапливающейся на парафиновой пленке или дисках бактериальной массы прямо пропорциональны уровню обсемененности исследуемых патологических материалов микобактериямн туберкулеза. Кроме того, у быстрорастущих вариантов первичный рост на парафиновых дисках или пленке появляется к 1 — 2 дню

5 15571 инкубирования, а прозрачная пленка

I между ними — к 1 — 3 дню, у медленнорастущих вариантов микобактерий первичный рост и прозрачная пленка еж- . ду ними появляются к 5 — 7 дню.

Предварительный результат по индикации различных видов микобактерий получают через 60-90 мин после внесения парафиновых дисков в жидкую пи- 10 тательную среду, зараженную патологическим материалом, или после посева патологического материала под пленку парафина путем микроскопии мазков, изготовленных соскабливанием флотированных микобактерий с нижней поверхности парафиновых дисков или пленки.

Окончательный результат индикации микобактерий туберкулеза можно получить через 1 — 3 — 5 — 7 дней, при 20 низкой обсемененности инфицированных патологических материалов — к 1О—

12 дню путем обнаружения характерного первичного роста микобактерий, инкубируемьк на арафиновых пленке и 25 дисках в жидкой минеральной или элективной питательной среде, и микроскопии окрашенных по Циль-Нильсену мазков, изготовленных соскабливанием, или пленки.

Пример 2. Для получения значительного количества массы микобактерий туберкулеза проводят пересев на 3 — 5 пробирок со средой Левенштейна-Иенсена путем втирания нижней поверхностью парафиновых дисков или кусочков пленки. Обильное накопление биомассы наблюдают через 18-24 ч, Пример 3. Для интенсивного накопления и длительного хранения 40 бактериальной массы различных видов микобактерий в колбу после появления характерного роста их на парафиновык дисках (через 3 — 5 дней). добавляют

10 — 20 мп стерильной элективной

45 жидкой питательной среды, которую каждый 2 — 3 мес. заменяют, доливая свежей в том же объеме, предварительно удаляя старую.

Пример 4. Для выяснения способности микобактерий к пигментообразованию суспензии исследуемого патологического материала, полученную растиранием его в ступке, разливают по 5 мл сразу в две стерильные колбы емкостью 50 мл, в которые доливают в равном объеме 5 мп) жидкую элективную питательную среду. К этой смеси пастеровской пипеткой с баллончиком

66 6 добавляют расплавленного до 50-56 С парафина по 30-40 капель в каждую колбу, которые застывают на их поверхности в виде дисков Р до 0 5 см.

Колбы закрывают стерильными пробками и на одной из них надписыв,"ют

"свет", на другои — "темнота", последнюю заворачивают в темную бумагу, обе колбы ставят в термостат при

37,5-38,5 С. Если после инкубации в течение 1 - 3 — 5 — 7 дней в обеих колбах на парафиновых дисках будут обнаружены колонии микобактерий с оранжевой окраской независимо от действия света, то это скотохромогенная культура микобактерий, если же после такого срока инкубирования обе колбы содержат колонии микобактерий с различной окраской (в колбе "свет"— желтоватая культура, в колбе "темнота" — кремовая}, то последнюю колбу без черной бумаги нужно поставить на солнечный свет и цвет колоний через 2-3 дня приобретет желтую окраску, т.е. если пигментация колоний на дисках появляется только под действием света, то это фотохромогенная культура микобактерий.

Определение способности микобакте" рий к пигментообразованию позволяет сократить срок дифференциации микобактерий этим тестом в 3-4 раза за счет упрощения приемов исследований, так как исключает длительное раздельное выделение микобактерий из патологическйх материалов, затем их культивирование в субкультурах на элективных твердых. яичных средах для накопления бактериальйой массы,дополнительного пересева на эти же яичные среды для изучения способности к пигментообразованию.

Формула изобретения

Способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогениэацию исследуемого материала, внесение парафина, посев в жидкую питательную среду, инкубирование с последующим выделением чистой культуры,о т.л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, непосредственно после гомогенизации добавляют питательную среду, после чего вносят расплавленный твердый парафин, инкубированию подвергают полученную смесь, а выделение чисто культуры осуществляют из застывшего парафинового слоя.