Способ определения дыхательной активности микроорганизмов

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к биотехнологическим процессам производства различных бактерийньк препаратов и продуктов микробиологического синтеза. Целью изобретения является увеличение чувствительности определения. Способ определения дыхательной активности культур микроорганизмов заключается в том, что к исследуемым микробным клеткам добавляют индикатор, в качестве которого используют суспензию пекарских дрожжей Saccharomyces сеге- visial, полученную путем культивирования на среде до накопления в клетках цинкопорфиринов, обеспечивающих люминесценцию 10 -10 с и инактивированную при в течение 20-25 мин с последующей отмывкой до концентрации 4-5 г/л. Измеряют время от момента внесения в исследуемый образец культуры микроорганизма до момента полного восстановления интенсивности свечения индикаторной культуры до стационарного значения, по величине которого оценивают дыхательную активность культуры. 5 ил., 1 табл. § (Л со 00 со со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (504 Ñ )2 1/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬС ГВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3967077/28-13 (22) 27.05.85 (46) 23.09.87. Бюл. h - 35 (71) Горьковский научно †исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии и Научно- исследовательский центр по автоматизации исследований в области физико-химической биологии (72) В.А.Антонов, А.И.Воронин, Ш.Х.Абэеев, С.А.Новиков и С.В.Иванов (53) 581.132 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 958495, кл. С 12 N 1/00, )982.

Петухов В.Г., Осин H.Ñ. Новьл флуориметрический метод контроля дыхательногo метаболизма бактерий, Стандарты, пп аммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов.

М., )982, с. 179-184.

Шувалов В.А., Красновский А.А. Люминесценция цинкопорфинов в микроорганизмах и растениях, фосфоресценция и замедленная флуоресценция. — Молекулярная биология,)971, т. 5, Р 5, с. 638-710, Савкин М.A., Корягина Т.A. Влияние лимитирующих факторов среды на биосинтез РНК н белка кишечной палочкой

М-17. Сравнительная физиология и биохимия микроорганизмов. Горьковский ун-т, 1973, нып. 1, сер. биол., с. 84-91.

„SU, 133913Î А 1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЫХАТЕЛЪНОИ

АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к биотехнологическим процессам производства различных бактерийных препаратов и продуктов микробиологического синтеза. Целью изобретения является увеличение чувствитсльности определения. Способ определения дыхательной активности культур микроорганизмов заключается в том, что к исследуемым микробным клеткам добавляют индикатор, в качестве которого используют суспенэию пекарских дрожжей Saccharomyces сетеvisial, полученную путем культивиро- ф вания на среде до накопления в клетках цинкопорфиринов, обеспечивающих

-2 -3 люминесценцию 1Π— 10 с и инактивированную при 80 С в течение 20-25 мин С с последующей отмывкой до концентрации 4-5 г/л. Измеряют время от момента внесения в исследуемый образец Оямаа культуры микроорганизма до момента полного восстановления интенсивности свечения индикаторной культуры до стационарного значения, rro величине которого оценивают дыхательную активность культуры. 5 ил., 1 табл.

1 1 З11ЗО

Изобретение относится к микробио— логии, а именно к биотехнологическим процессам производства различных бактерийных препаратов и продуктов мик5 робиологическо го синтеза.

Цель изобретения — увеличение чувствительности определения.

Способ определения дыхательной активности культур микрооргани нов заключается в следующем.

В кварцевую кювету помещают исследуемьп образец культуральной суспензии. В образец вносят порцию кислорода в виде определенного объема физиологического раствора, в который предварительно добавлягот определенный объем индикаторного раствора, приготовленного путем специальной обработки из суспензии клеток микроорганизмов, выраженных при оггределеггньгх условиях, обеспечивающих накопление значительных количеств внутриклеточных веществ цинкопо рфирино вой Itp H оды. 28

Сахароза

ZnS0 7П Р

50,0

О, 0029 (концентрация подобрана экспериментально и является опти мальной для накопления длительно люминес4 5

Измеряют время от момента внесения в исследуемый образец культуры микроорганизма указаггггого раствора до момента полно го восстановления ин— тенсивно сти свечения индикаторной культуры до стационарного значения.

Концентрация остаточного кислорода в суспензии в этом случае меньше 10 -" М.

В качестве индикаторного раствора, содержащего вещества, обладающие способностью к замедленной r!лyоpe пенции, которая тушится растворенным в среде кислоро rnM, используют пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisi.al, выращенные предварительно в условиях, обеспечивающих накопление в клетках высоких пулов соединенгц1 цинкопорфириновой природы.

Методика пргггогонления индикаторной культуры заключается в следующем.

Культуру промыгиленного штамма Saccharomyces cerevisia1 выращивают на стандартной синтетической питательной 5гг среде следynmего состава, г.

Г!а >HFO,г 121 г О 0,5

КЦ PO 0,5

NaCl 5,0

NgSo4 7ПР О, 138 55

Na SC 1 21".,0 1, 35

Na СО, 1,8

Лимонно кислый аммоний цирующих соединений) .

Выращивание проводят при 28 С без гринудительной аэрации в колбах в течение 72 ч.

По окончании процесса культивирования проводят контрольное измерение уровня интенсивности замедленной флуоресценции с целью оценки концентрации синтезированных цинкопорфириновьгх соединений. Вычисляют удельную концентрацию флуорофора на единицу биомассы.

Культуральную суспензию дрожжевых клеток инактивируют посредством термической обработки при 80 С в течение 20-25 мин. Проводят повторный контроль характеристик замедленной флуоресценции дрожжевой культуры.

Свечение должно полностью отсутствовать. Это объясняется тем, что при указанных условиях термической обработки инактивируется эндогенное клеточное дыхание и растворенный в среде кислород тушит замедленную флуоресценцию клеточных цинкопорфиринов.

Полученную инактивированную культуру центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин и ресуспендируют в физиологическом растворе до конечной концентрации 100 г/л.

Индикаторную культуру хранят в плотно закрытом сосуде при пониженной температуре (+4 С ) в течение шести месяцев в условиях, не требующих стерильности.

Перед измерением дыхательной активности исследуемой культуры микроорганизма индикаторную суспенэию разводят физиологическим раствором до концентрации 5 г/л. Температуру индикаторного раствора доводят до температуры исследуемого образца культуры.

При проведении измерений необходимо, чтобы концентрация индикаторного флуорофора в смеси оставалась постоЬ янной. Как показали предварительные исследования, обычно при одном измерении требуется 1 мл анализируемой культуры и 1 мл индикаторного раствора ° 10

Предлагаемый способ измерения дыхательной активности микроорганизмов основан на том, что активная анализируемая культура утилизирует внесенную порцию кислорода. При снижении 1g концентрации растворенного кислорода в смеси до уровня IO М и ниже уст( раняется эффект тушения кислородом замедленной флуоресценции цинкопорфиринов индикаторной культуры. Способ 2р позволяет контролировать скорость потребления кислорода анализируемой культурой на основании измерения динамики восстановления интенсивности замедленной флуоресценции индикатор- 25 ной культуры, активности культур микроорганизмов, не обладающих собственной замедленной флуоресценцией, например, для измерения скорости потребления кислорода культурой Esche- З0

richia coli M-17 при производстве лечебно-профилактического препарата колибактерина, культурой Baccillus subtilis (продуцента рибофлавина), культурой Brevibacterium flavum (продуцента гомосерина).

Пример 1. Культура Escherichia coli М-17. Среда для культивирования — M9. Источник углерода и энергии — глюкоза 0,37.. Периодичес- 40 кое выращивание в ферментере рабочим объемом 2 л. Скорость аэрации 1 л/1 среды в минуту. Скорость вращения мешалки 900 об/мин.

В процессе выращивания отбирают 45 пробы культуральной жидкости (O,l

l,0 мл в зависимости от дыхательной активности популяции )и помещают в кварцевую кювету. Туда же вносят

0,1 мл индикаторной суспензии и наслаивают тонкий слой технического жидкого масла. Суспензию облучают видимым светом с помощью галогенной лампы. Приемником излучения служит

ФЭУ. Флуоресцентный сигнал усиливает- 55 ся микровольтметром и регистрируется на ленте самописца. Регистрируется длительная люминесценция с временем жизни 2 IО < . По наличию флуоресцен.

1 30 4 тного сигнала судят об отсутствии растворенногo кислорода в O6p;lsöå и к анализу приступают после появления сигнала. Вводят в образец порцию физиологического раствора (0,1 — 1,0 мл а зависимости от активности дыхания микробных клеток ). Регистрируют время от момента введения в образец порции растворенного в физиологическом растворе кислорода до момента выхода на стационарный уровень сигнала длительной люминесценции веществ индикаторных клеток.

На -фиг.l представлены результаты измерения величин концентрации биомассы (1), скорости потребления растворенного кислорода культурой Е.coli

M-17 в процессе культивирования предлагаемым способом (2). Для сравнения приведены результаты измерения дыхательной активности популяции с использованием газового анализатора (3).

Минимальная чувствительность газового анализатора (0,5X) не позволяет измерять величину скорости потребления кислорода менее, чем 0,2 г л ч (фиг.2) при используемом режиме аэрации и перемешивания. В то же время предлагаемый способ позволяет при этих условиях регистрировать указанную величину до значений 0,001 г л ч

В течение всего 10-часового процесса культивирования не было отмечено наличия длительной люминесценции у самих живых клеток Е.coli М-17, что не позволяет использовать для тестирования дыхательной активности данной популяции известный способ.

Пример 2. Культура E coli

М-17. Среда для культивирования — мясопептонный бульоí. Источник углерода и энергии — глюкоза (17). Культивирование в ферментере с рабочим объемом

30 л с целью производства лечебнопрофилактического препарата колибактерина. Условия аэрации и перемешивания, а также процедура измерения дыхательной активности бактериальной суспензии аналогичны изложенным в-. примере I.

В табл.l представлены результаты измерения скорости потребления кислорода популяцией Е.coli M-17 в процессе культивирования предлагаемым и известным способами.

Накопление длительно люминесцирующих соединений в самих живых клетках кишечной палочки при исследованном

1339130 регламенте выращивания отмечается лишь к концу процесса (б-7 ч 1. Следовательно, использование известного метода измерения дыхательной актив5 ности микроорганизмов на протяжении большей части процесса культивирования F.. co l i M-1 7 невозможно. Применение предлагаемого способа позволяет контролировать скорость потребления кислорода данной микробной популяцией на протяжении всего процесса выращивания.

Пример 3. Культура Васд11ыз

subtilis 304-23,,генетически изменен- 1В ный штамм — продуцент рибофлавина.

Среда для культивирования — селективная среда Спицайзена. Ферментер объемом 2 л. Условия аэрации и перемешивания, а также процедура измерения дыхательной активности микроорганизма аналогичны примеру 1.

На фиг.3 представлены результаты измерения дыхательной активности популяции Вас. subtil is в процессе пе- 25 риодического культивирования предлагаемым способом. Обнаружено, что на протяжении всего исследуемого процесса клетки Bac. subtilis»e содержат длительно люминесцирующих соединений 10 цинкопорфириновой природы, что делает невозможным использование изве стного способа. Применение предлагаемого способа позволяет производить оценку скорости потребления раствозб ренного кислорода популяцией Вас. sub.

tilis на протяжении всего процесса выращивания .

Пример 4. Культура Micrococcus glutamicus 95, генетическиизменеп-,ц>

1 ный штамм — продуцент лизина. Состав среды для культивирования (содержание компонентов среды в 1 л),: фос-форнокислый аммоний 2; сернокислый аммоний 2; сернокислый магний 0,5; сернокислый марганец 0,04; меласса

30; кукурузный экстракт 5.

Процедура выращивания штамма и измерения дыхательной активности кле— ток аналогичны примеру 1.

ВО

На фиг.4 представлены результаты измерения в процессе выращивания И.

glutamicus 95 скорости потребления растворенного кислорода микробными клетками предлагаемым способом. Ре— эультаты проведенных исследований показали необходимость использования известного способа для контролирования дыхательной активности популяции ввиду отсутствия в клетках исследуемого микроорганизма на протяжении всеro процесса выращивания замедленно флуоресцирующих соединений цинкопорфириновой природы.

Пример 5. Культура Brevibacterium flavum 2Т, генетически измененный штамм — продуцент гомосерина.

Условия культивирования и измерения дыхательной активности клеток аналогичны примеру 4.

На фиг.5 изображена динамика дыхательной активности исследуемой попу— ляции в процессе периодического культивирования. Измерения проводились предлагаемым методом. Не отмечено накопление в клетках исследуемого микроорганизма собственных замедленно флуоресцирующих веществ цинкопорфириновой природы. Следовательно, использование известного способа для измерения скорости потребления кислорода микробными клетками в исследуемом технологическом процессе невозможно.

Таким образом, способ контроля дыхательной активности микроорганизмов обеспечивает проведение измерений скорости потребления растворенного кислорода микробными модуляциями, в клетках которых не содержится собственных замедленно флуоресцирующих соединен п1, изменяющих параметры своего свечения в зависимости от содержания растворенного кислорода в культуральной жидкости.

Динамический диапазон измеряемых предлагаемым способом скоростей потребления кислорода обеспечивает надежный контроль за дыхательной активностью микробных популяций на протяжении всего процесса выращивания перечисленных видов микроорганизмов.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ определения дыхательной активности микроорганизмов путем выращивания их на питательной среде, отбора исследуемой пробы суспензии, облучения ее светом с последующей регистрацией длительной люминесценции и введением в пробу порции кислорода, растворенного в физиологическом растворе, измерения времени от момента окончания аэрации до восстановления свечения по величине, которой оценивают дыхательную активность культуры, а скорость потребления растворен1ЗЗЭ1З0

Т а Ь л м u ° I

Значенна сяоростн ° г/п.ч, ° рачлнчнне ярененнне ннтграалн 1ч ) от начала промесса ятльтнанроаанна

Способ

L Т

3 ь о I 2

3 21!0,11 2 95 0,11

Иааесгнр

Преллагаемеп 0,0740,01 о, IOlо,OI <1,14 0,10 о,вгсо,03 г, l 190,08 2,91 о, 10 3,31го,12 3,0040,11,Ч б

Фиг.1 ного кислорода клетками исследуемого микроорганизма определяют по результатам измерения времени от момента окончания аэрации до восстановления свечения длительно люминесцирующих соединений, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности определения в отобранную чробу культуральной жидкости вносят индикатор, в качестве которого используют суспензию пекарских дрожжей

Saccharomyces cerevisial, полученную путем культивирования, до накопления в клетках цинкопорфиринов, обеспечивающих люминесценцию 10 2 -10 с и инактивированную при 80 С в течение

20-25 мин с последующей отмывкой до концентрации 4-5 г/л.

1339!30

1,0

Фиг.Г

4 д 12 18 И 24 88 Ю2

ФАЗ

1 339130 х х х х

„Г

8 7Е 84 Л 40 48 SE E4 Р (Рог.5

Составитель Л. Борисова

Редактор A. Пишкина Техред И.Дидык

Корректор И. Эрдейи

Заказ 4183/)7 Тираж 499 Подписное

ВРИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Лроизво, <:ч яенно-полиграфйческое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4