Способ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот

 

Изобретение относится к молекулярной генетике и касается идентификации вирусов и бактерий методом сэндвич-гибридизации. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Повышение чувствительности обнаружения бактерий CHLAMYDIA цитомегаловируса, вируса простого герпеса, вируса папиломы человека обеспечивается за счет использования серий чередующихся фрагментов нуклеиновых кислот, нанесенных на твердый носитель, и меченых реагентов. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3856877/30-13 (22) 15.02.85 (31) 840655 (32) 17.02.84 (33) Р1 (46) 15.11.89. Бюл. Ф 42 (71) Орион-Ихтюмя Ой (Р?) (72) Аири Марьятта Палва, Туула Уарьют Ранки и Ханс Эрик Седерлунд (РТ) (53) 575.224.2,547.2(088.8) (56) Патент США 11 4486539, 436-504, 1984.

Изобретение относится к молекулярной генетике и касается идентификации вирусов и бактерий методом сэндвич-гибридизации.

Белью изобретения является повышение чувствительности способа.

Повышение чувствительности обнаружения бактерий Chlamydia цитомегаловируса,. вируса простого герпеса, ви= руса папиломы человека, обеспечивается за счет использования серий чередующихся фрагментов нуклеиновых кислот, нанесенных на твердый носитель и меченных реагентов.

Пример I. Фрагменты ДНК, пригодные для диагностики группы Chlamydia trachomatis приготавливают иэ

ДНК Chlamydia trachomatis серотипа

Ь 2. Данную ДНК извлекают и фрагменI тируют известными способами, получен„„SU„„ I 523053 А 3 511 4 С 12 N 15/00, С 12 Q 1/02 (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦ1П1 ВИРУСОВ И

БАКТЕРИЙ, ОСНОВАННЫЙ HA СЭНДВИЧ-ГИБРИДИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (57) Изобретение относится к молекулярной генетике и касается идентификации вирусов и бактерий методом сэндвич-гибридизации. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Повышение чувствительности обнаружения бактерий Chlamydia цитомегаловируса, вируса простого герпеса, вируса папиломы человека обеспечивается за счет использования серий чередующихся фрагментов нуклеиновых кислот, нанесенных на твердый носитель, и меченых реагентов, 6 табл, ные фрагменты ДНК клонируют в плазмиду pBR322 и переносят в организм хозяина Escherichia coli К12 НВ101 известными способами, В результате данного клонирования получают генный банк бактерий Chlamydia trachomatis

L 2, т.е получают большое число рекомбинантных плазмид, каждая из которых имеет раздельный ограничительный фрагмент Ваш Н1 от ДНК хламидии, Для получения реагента из генного банка отбирают рекомбинантные плаэмиды, содержащие максимально большие . В вставки ДНК, полученные от ДНК хладидий. Одну такую плазмиду обознача- (4 ют рКТН1220, которую сдали на хранение в Центр коллекций культур Deutsche

Sammlung von Microorganismen под номером (DSM2825), и пригодность которой для использования в качестве ре—

1523053 агента демонстрируют способом прямой гибридизации. Испытание показало, что

РКТН1220 идентифицирует все нуклеиновые кислоты от различных серотипов

Chlamydiа trachomatis но не идентифи5 пирует никакие другие нуклеиновые кислоты.

Фрагменты, полученные с использованием различньгх эндонуклеаз рестрикции, получают от ДНК плазмиды РКТН1220 и некоторые из зтнх фрагментов переносят при последующем клонировании в плазмиду рАТ153 и некоторые в фаг М13.

Фрагменты„ принадлежащие к серии в, используют как меченые пробы, В табл,l приведены размеры этих фрагментов и векторов, используемых для последующего клонирования, названия рекомбинаитных плазмид и их использование.

Фрагменты, приведенные в табл. 1, выделяют из агароэного геля методом электроэлюирования и клонируют в соответствующие сайты рестрикции векторов,25 приведенных в табл. 1, используя для этого уже известные способы, Фрагмент BamH1 BamHl 2,1 кв получают следующим образом. Фрагменты BamH1Sall 1,4 кв и Sal I-Bam H I 0,7 кв плаэмиды РКТН1220 разделяют гель электрофореза в агарозном геле, из которого их извлекают. Очищенные фрагменты связывают друг с другом посредством фермента Т4 лигазы, и иэ фрагментов

ДНК 2,1 кв,,полученных в данной реакции, те которые имеют свободные концы

Ватп HI äîïoëíèòåëüío связывают с ограничительной точкой Bam HI двойной молекулярной нити фаговой ДНК М13

mp 8.

Таким образом получают рекомбинантный фак-ДНК (п4КТН1245), . содержащий

ДНК Chlamydia trachomatis> включающую два раздельных фрагмента ДНК, которые не располагаются непосредственно рядом друг с другом в данном геноме.

Однако в данном геноме их располагают по соседству с рКТН1250 и РКТН1254

ДНК-реагентами, которые связаны с фильтром.

Проводят исследование чувствительности ряда нуклеиновых кислот как реагентов в сравнении с непрерывной парой реагентов, используя способ сэндвич-гибридизации. Данное испытание осуществляют с использованием фильт4! ров, каждый из которых содержит 10 молекул как РКТН 1250 (а ),. так и

РКТН1252 (а4) ДНК в виде одной молекулярной нити. Исследуемый образец представляет собой плазмиду РКТН

1220, которая в данном испытании вытягивается в одну нить при кипении в течение 5 мин в 0,17 M NaOH после о чего температуру снижают до О С и осу— ществляют нейтрализацию равномолярным количеством уксусной кислоты. В данном испытании используют нижеследующие пробы меченые 125|1. — перечисленные в табл. 1: mKTH)242 (Ь,), mKTH1239 (Ь ), mKTH1248 (b ) и

mKTH1245 (Ъ,-Ь ).

Гибридизацию осуществляют при +65 С ф в течение 17 ч в растворе гибридизации, имеющим следующий состав. 4 х х SS С, 0,02% Ficoll, 0,02% поливинилпирролидона, О, 2% додедилсульфоната натрия (SDS) и 200 мкг/мл ДНК спермы сельди. Фильтры промывают в течение

2 ч при 50 С промывочным раствором, имеющим следующий состав: 0,1 х SSC

0,2% SDS и осуществляют подсчет с использованием гамма-счетчика. Результаты приведены в табл. 2 и каждый результат представляет собой среднее значение пяти параллельных испытаний.

Статистически рассчитывают,что 95%| допустимый предел испытаний, осуществляемых без образца (отрицательный контрольный), рассматривается как нижний предел позитивности. Эти значения составляют 52-54 отсч/мин, когда проба представляет собой Ъ„ Ь или Ьз, 2

58 отсч/мин, когда проба представляет собой Ь4 . Ь; 56. отсч/мин, когда проба представляет собой Ъ| -Ь, и

65 отсч/мин, когда проба представляет собой(Ъ„-Ь 1 Ь

Пример 2. Образцы, взятые от трех мужчин, страдающих уретритом, и от трех женщин, страдающих цервицитом, отбирают для испытания. Chlamydia trachomotis берут из мочеиспускательного канала мужчин, женские обраэць4 берут из шейки матки женщин.

Кроме того, прдводят исследование соответствующего числа аналогичных -образцов пациентов, из которых хламидии не отбирают, Подвергаемые исследованию образцы отбирают с помощью тампонов с хлопковыми концами, которые погружают в буферный раствор с растворенным образцом хламидий, содержащий

0,2 М сахарозы, 20 мМ фосфатного буфера 3% сыворотки плода теленка, 5 152305

10 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ванкомицина и 25 ед/мл нистатина.

Хламидии из данных образцов подвергают культивированию, Исходные образцы также анализируют посредством

5 сэндвич-гибридизации с использованием ряда фрагментов нуклеиновых кислот.

Данные образцы концентрируют с использованием 2-бутанола с целью удаления из них жидкости таким образом, чтобы конечный объем составлял примерно

80 мкл, и таким образом концентрация этих образцов для испытания возрастает примерно в 3-7 раз. После этого в образец вводят 70 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 0,77 додецилсульфата натрия (SDS), 20 мкг/мл фермента К протеиназы и осуществляют обработку в течение 15 мин при 55 С и в течение 45 мин при 37 С. После этого образец кипятят в течение 5 мин в 0,175 М NaOH. Подвергнутый кипячению образец охлаждают до О С. и нейтрализуют равномолярным количеством 25 уксусной кислоты и подвергают испытанию, В испытании используют фильтры в условии гибридизации, описанные в примере 1, Используемая проба представляет собо" mKTH 1245 (Ь,-Ь ), 300000 отсч/мин 400 мкл раствора гибридизации.

Результаты гибридизации представлены в табл. 3.

Предел позитивности в данных испытаниях составляет 104 отсч/мин, Результаты, приведенные в табл. 3, показывают, что сэндвич-гибридизация, осуществляемая с использованием ряда фрагментов нуклеиновых кислот, при- 40 годна для диагноза венерических заболеваний. Образцы, которые были нега.— тивны при испытаниях культуры, были также негативны в испытании сэндвич. гибридизацией.

Пример .3. Фрагменты ДНК, пригодной для диагностики цитомегаловируса, приготавливают из цитомегаловируса (AD169, ATCC VR-538) -(CMV), ДНК выделяют и фрагментируют уже из- 50 вестными способами. Фрагмент 1 Е coRI длиной примерно 9 кв извлекают из агарозного геля путем электроэлюиро» вания после того, как отделяют фрагменты- EcoRI на основе их размера.

Элюированную .ДНК экстрагируют фенолом, после чего ее осаждают этанолом, Очищенную таким образом ДНК связывают посредством Т-4 лигазы с вектором

3 6 плазмиды рВ 325, обработанным EcoRI ферментом, образующуюся рекомбинантную

ДНК переносят в бактериального хозяина Е. coli K12 НВ101. Из числа стойких к ампицилпину и тетрациклину, но чувствительных к хлорамфениколу клонов выбирают такой, который содержит специфическую для цитомегаловируса вставку ДНК необходимого размера. Характер клонированной ДНК цитомегаловируса определяют методом нанесения пятен Southern. Такое испытание показывает, что описанный фрагмент

EcoRI-ДНК размером 9 кв получен от

ДНК цитомегаловируса и, в частности, он включен в его фрагмент Hind III 9 °

Описанную рекомбинантную плазмиду обозначают KGK рКТН1271 и сдают на хранение в Центр коллекции культур

Deutsche Sammlung von Microorganismen под номером DSM 2826, Последующие клонирования осуществляют уже известными способами с использованием в качестве векторов плазмиды рВ 322 и фагов М13 mp7 и М13

mp8. Ряд фрагментов нуклеиновых кислот приготавливают с использованием ограничительных фрагментов Е coRI

Bam HI, Cla I u Pst I. В табл. 4 приведены размеры данных фрагментов и векторы, используемые для дальнейшего клонирования, и даны названия образуемых таким путем рекомбинантных плазмид и их использование либо в качестве фильтр-реагентов, либо в качестве меченых проб °

Исследуют чувствительность ряда нуклеиновых кислот как реагентов в сравнении с непрерывной парой реагентов с использованием способа сэндвичгибридизации, Образец для испытания в данном случае представляет собой ДНК

CMV (ДНК цитомегаловируса), который подвергают кипячению в 0,17 M NaOH в течение 5 мин и затем нейтрализуют, как и в примере 1, В данном испытании используют фильтры, каждый иэ коИ торых содержит 10 молекул как рКТН1273 (а, ) ДНК, так и рКТН1274 (а )

ДНК, в виде однониточной молекулы, и нижеследующие пробы, меченые 125, перечисленные в табл. 4: КТН1277 (Q,)

mKTH1278 (Ь ) и ТН1.279 (Ь ) . Каждая из проб содержит 10 отсч/мин/мкг

Э

ДНК, Гибридизацию осуществляют как описано в примере 1, Полученные результаты приведены в табл. 5.

1523053

В данном испытании нижний предел позитивности составляет 51 55 отсчетов/мин, когда проба представляет собой Ь „° Ь или Ь 59 отсч/мин, когда проба представляет собой Ь, b

1 2 и 63 отсч/мин, когда проба представляет собой b b ° Ь .

Результаты, приведенные в табл.5, пок азыв ают, что сэндвич-гиб ридизация, в которой используют индивидуальную пробу реагент(b, Ь или Ь ), в каждом случае обнаруживает 4х106 молекул ДНК CM V. С другой стороны гиб-15 ридизация, осуществляемая с реагентом (Ь, ° Ь или Ъ, ° Ь ° Ь ), обнару6 живает лишь 10 молекул ДНК CMV. Данные результаты показывают, что ряд нуклеиновых кислот, как реагентов, 20 в четыре раза чувствительнее индивидуальных нуклеиновых кислот, как реагентов.

Клинические образцы подвергают анализу путем сэндвич-гибридизации с использованием ряда реагентов. Эти образцы включают два образца мочи, взятой у детей до одного года ° Эти дети страдают врожденным большим эритроцитом (CMV). Данным способом сэндвич-гибридизации анализируют также образец, взятый путем биопсии легкого у пациента с инфекционным легочным цитомегаловирусом (СНУ). В качестве образцов в данном испытании используют также зараженные и незараженные цитомегаловирусом клетки человеческого з ародыша, В 10 мл образца мочи вводят раствор, содержащий 1 саркозила и 5 мХ

40 этилендиаминтетраук сусной кисло ты и

200 мкг ДНК от зобной железы теленка, после чего ДНК, выделенную из вируса, вместе с носителем осаждают, используя 10 мл изопропанола, при комнатной температуре, Осажденную ДНК растворяют в 200 мкл буферного раствора

ТЕ и переводя в в форму однониточной молекулы путем кипячения в течение

5 мин, после чего раствор ДНК охлаждают до 0 С и вводят в раствор гиб— о, 50 ридизации.

Образец биопсии легкого (несколько мм ) механически измельчают ножом и в него вводят 200 мкл буферного раствора ТЕ, <одержащего 1 .-ного раствора додецилсульфата натрия (SOS) и

1 мг/мл фермента К протеиназы, Вываривание асуще(tBJIBloт в течение 1 ч при +37 С, после чего образец проо пускают дважды в шприц для инъекции через тонкую подкожную иглу. Гомогенизированный таким путем образец подвергают кипячению, после чего его вводят в испытываемый раствор.

Зараженные цитомегаловирусом клетки и незараженные клетки разрушают под действ ием додецилсульфата на трия и К протеиназы, гомогенизируют и подвергают кипячению, как указано выше.

Реагенты в испытании гибридизацией представляют собой рКТН 1273 (а„) и рКТН1274 (а ) на фильтрах и тКТН1277 (Ь„), rn KTH1278 (Ь, ), m KTH1279 (Ь, )в качестве проб, каждый 200000 отсч/мин на реакцию . В других случаях гибридизацию, промывку и отсчет результатов осуществляют как описано в примере 1.

Результаты данной гибридизации приведены в табл. 6.

Результаты, представленны в табл.б, показывают, что используя ряд нуклеиновых кислот как реагентов, можно обнаружить цитомегаловирус с различных клинических образцах, таких как моча, образцы биопсии легкого и клетки, Данное испытание специфично для цитомегаловируса, оно не идентифицирует ДНК человека, т,е. данному испытанию не препятствует ДНК человека, присутствующая в испытываемом образце. Фактически тип образца не влияет на специфичность данного испытания.

Формула изобретения

Способ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот, включающий контактирование пробы нуклеиновой кислоты с первым фрагментом нуклеиновой кислоты, нанесенным на твердый носитель реагентом, и вторым фрагментом нуклеиновой кислоты, меченым реагентом, с последующим радиоактивным анализом, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, при идентификации бактерий рода Chlamydia берут две серии чередующихся фрагментов нуклеиновой кислоты, причем в качестве реагентов, нанесенных на твердый носитель, используют фрагменты GlalSal I размером 3,0 кв и Sal I — Cla I размером 2,9 кв плазмиды рКТН1220, субклонированные B векторе рАТ153, 1523053

Таблица1

Фрагмент

Размер Вектор Рекомбинатная плазмида

Использо.вание рАТ153 рКТН1252 рАТ153 рКТН1250

M13mp8 mKTH1242

M13mp8 mKTH1239

M18mp8 mKTH1248

M13mp8 mKTH1245

a„Cl aI- BalI а Sal I -Clal

Ь, SalI-BamH1

Ь ВапйП-SalT

Ь ClaI-ClaI

b -bzBamHI-BamHI

3,0 кв

2,9 кв

0,7 кв

l,4 кв

1,7 кв

2,1 кв

Фильтр

Фильтр

Меченая

Меченая

Меченая

Меченая проба проба проба проба и мечеными реагентами являются фрагменты Sal 1 — Bam HI размером 0,7 кв, Bam HI — Sal I размером 1,4 кв и

Cla I - Cla I размером 1,7 кв плазмиды рКТН1220, субклонированные в фаг

М13 mp8, причем фрагменты Sal I

Bam HI u Bam HI — Sal I сшиты между собой с образованием фрагмента Ватп HI

Ватп HI размером 2,1 кв, при идентификации цитомегаловируса в качестве нанесенных на носитель реагентов используют фрагменты EcoR 1 — Pst I размером 3,3 кв и Cla I — Bam HI размером

3,0 кв плазмиды рКТН1271, субклонированные в вектор pBR 322, а в качестве меченых реагентов используют фрагмент Pst I — Pst I размером О, 6 кв плазмиды рКНТ1271, субклонированный в плазмиду М13 mp 7, и фрагменты

Pst I — Cla I размером 1,О кв и Bam HIEcoR I размером 1,0 кв плазмиды рКТН

1271, субклонированные в фаг М13шр8, при идентификации вирусов простого герпеса типа 1 в качестве реагентов, нанесенных на твердый носитель, используют два фрагмента EcoRI-Pst I размером 1,1 кв и два фрагмента Pst

Ват НЕ размером 1, 5 кв плаэмиды рКТН1359 субклонированных в фаги М13

mp10 и N13mpli, а в качестве меченых реагентов используют фрагмент Hind

III — EcoR I размером 1,9 кв плазмиды рКТН 1359, субклонированный в плазмиду pBR325, фрагменты Pst I- Pst I размером 1,8 кв и Hind III — Bam HI

35 размером 1,3 кв плазмиды рКТН 1 359, субклонированные в плазмиду рВК322, и при идентификации вирусов простого

-.ерпеса типа 2 в качестве реагентов, нанесенных на твердый носитель, используют два фрагмента Hind III-Pst I размером 2,0 кв и два фрагмента Pst IHind III размером 1, 2 кв плаэмиды

pKTH135i, субклонированные в фаги

Nl3mp 10 и М13тр li, а в качестве меченых реагентов используют фрагмент

Pst I — Pst I размером 5,7 кв плазмиды рКТН 1351, субклонгрованный в плаэмиду pBR322, и при дополнительной идентификации вируса папиломы человека типа 11-ЧПВ 11 в качестве реагентов нанесенных на твердый носитель, используют два фрагмента Bam Н?-Pst I размером 1 4 Psti IPst I размером 0,8 кв и два фрагмента Pst I — Pst I размером 0,9 кв генома ЧПВ 11, субклонированные в фаги

М13 йр 10 и Е13 mp 1i, а в качестве меченых реагентов используют два фрагмента Pst I — Pst I размером 1,7 кв и 1,5 кв генома вируса папиломы человека типа 11> субклонированные в плазмиду pBR 322, и при идентификации вируса папиломы человека типа 16 в качестве реагентов, нанесенных на твердый носитель, используют по два фрагмента Pst I — Pst I размером

1,7 кв и 1,1 кв генома ЧПВ 16, субклонированные в фаг М13шр 10, а в качестве меченых реагентов используют фрагмент Bam 111 — Pst I размером

2,7 кв и 0 5 кв генома вируса пагиломы человека типа 16, субклонированные в плазмиду рВР. 322.

1523053

Таблиц а 2

Гибридизированная радиоактивность (b) в качестве пробы

Образец молекул/испытание

Ь Ь b " b, .b (b Ь г) 39 52

68 140

416 686

2637 3580

33 49

48 93

234 396

1456 2912

37 37

48 44

226 236

1475 1415

108 отсч/мин/испытание; 5 10 отс/мин/ мкг ДНК т отсч/мин/испытание; 4 10 отсч/мин/ мкг ДДК отсч/мин/испытан.; 5>10 отс4/мин/мкг ДНК; отсч/мин/испытание; 7 1О отсч/мин/мкг ДНК; т о тсч/мин/испытание; отсч/мин/испытание.

АМ-Ь

%АФ а Ь я я 2 (Ь„-Ъ ) Ь, 380000

700000

Таблица 3

Образец

30-55

419

Таблица4

PBR322

pBR322

MI3mp7

М13тпр8

МХЗтр8 рКТН1273 рКТН1274

mKTH1277

mKTH1278

mKTH1279

Фильтр

Фильтр

Меченая проба

Меченая проба

Меченая проба

Мужчина 1

11

lI

11

11 6

11

Женщина 1

11

Il

11

11

l1

Буферный раствор, Х4

Chl. erachomatis

2 Бактерии, 1О

Ограничительный фрагмент а„ЕсоВХ-Pstl (3,3 кв) а clal-BamHI (3,0 кв)

Ь, Ps4I-Рз1? (0,6 кв)

b< PstI-claI (1,О кв) з

Гибридизиро- Результаты ванная радио развития активность хламидий

151

164

154

61

76

343

509

362

57

58

Вектор Название Использование

13

1523053

Т а б л и ц а 5

Гибридизированная радиоактивность с использованием (Ь) в качестве пробы

Образец

b Ь b ° д,2 Ь< Ь Ь молекул/испытание отсч/мин/испытание; отсч/мин/испытание; отсч/мин/испытание; отсч/мин/каждого испытания; отсч/мин каждого испытания. !

Таблица 6

Гибридизированная Выделерадиоактивность ние вируса

Образец

Зараженные клетки (10 )

Моча 1 (10 мл)

Моча 2 (l 0 мл)

Моча от

3521

243

3215

535

Цитомегаловирус

Не дано

65

Не дано разца

Составитель Н ° Кузенкова

Редактор А. Долннич Техред Л.Сердюкова Корректор О.Ципле

Заказ 6985/59 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

О

4 10 б

1,6 10 ь, 310000

b2 320000

Ьэ 300000

Ь ° b ЗООООО

b Ü Ь, ЗООООО здорового пациента (10 мл)

Образец биопсии легкого

Контрольные клетки 10

Нет об35 ° 33 38

38 44 46

85 135 142

203 254 265

415

Не дано

Цитомегаловирус

Цитомегаловирус

Не дано

53

292

645