Способ получения препарата фотосинтетических реакционных центров, содержащих фотоактивные цитохромы

 

Изобретение относится к биохимии и биофизике и может быть использовано в биоэлектротехнике и биотехнологии, а также для исследования фундаментальных проблем фотосинтеза. Цель изобретения - упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта. Для этого мембраны пурпурных серных бактерий обрабатывают 60-70%-ным ацетоном в присутствии дитионита натрия в концентрации 0,08-0,17%. Затем осадок экстрагируют смесью ионного (хорат натрия) и неионного (тритон X-100) детергентов и дитионита натрия. Экстракт хроматографируют на колонке с гидроксилапатитом и элюируют тритоном X-100. При этом количество операций по сравнению с прототипом сокращается с 9 до 5. Целевой продукт сохраняет нативные свойства и является высокоочищенным, что подтверждено данными электрофореза в полиакриламидном геле и адсорбционной спектроскопии. 1 табл.

СОЮЗ СООЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

КСПУБЛИН (5) )5 С 12 P 21/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHAM

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21 ) 441 3938 t 31- i 3 (22) 20. 04. 88 (46) 15.05..90. Бюл. 1 - 18 (71) МГУ им. М.В. Ломоносова (72) Ян Сабо (CS), Н.И. Захарова, Н.Я. Успенская, С.К. Чамовровский и А.А. Кононенко (SV) (53) 54 1 . 14 1 (088 . 8) (56) Tiede D .N., Prince R.Ñ., Dutton P,L., 1 976, BBA, v. 449, р. 447467. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПЕРАТА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ,:

СОДЕРЖАЩИХ ФОТОАКТИВНЫЕ ЦИТОХРОМЫ (57) Изобретение относится к биохимии и биофизике и может быть использовано в биоэлектротехнике и биотехнологии, а также исследования фундаментальных проблем фотосинтеза. Цель

Изобретение относится к биохимии и биофизике и может быть использова» но в биоэлектронике и биотехнологии, а также для исследования фундаментальных проблем фооосинтеза °

Целью изобретения является упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Изобретение иллюстрируется следую-; щими примерами.

Пример 1. Клетки серных бактерий вида Chromatium minutissimum штамм Ф 1 или 1.1 выращивают фототрофно на среде Ларсена 3-5 дней, собирают центрифугированием, замораживают. Размороженные клетки суспендируют в 1 О мМ фосфатном буфере рН 7,0, содержащем 10 з М этилендиаминтетра„.SU„;;1564190 ., А1

2 изобретения — упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Для этого мембраны пурпурных серных бактерий обрабатывают 60-707-ным ацетоном в присутствии дитионита натрия в концентрации 0,08-0,17Х. Затем осадок экстрагируют смесью ионного (хорат натрия) и неионного (тритон Х100) детергентов и дитионита натрия.

Экстракт хроматографируют на колонке с гидроксилапатитом и элюируют тритоном Х-100. При этом количество операций по сравнению с прототипом сокращается с 9 до 5, Целевой продукт сохраняет нативные свойства и является высокоочищенным, что подтверждено данными электрофореза в полиакриламидном геле и адсорбционной спектроскопии. 1 табл. уксусной кислоты, озвучивают на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-1 при частоте 22 кГц, токе 0,4 А в течение ф

3 мин. Раствор центрифугируют 30 мин при 10000 g, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость центрифугируют при 144000 g 2 ч. Хроматофоры, 4 полученные в виде осадка, суспендируют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7 и разводят до концентрации 400 мкМ бактериохлорофилла, высаливают 70Х-ным охлажденным ацетоном в присутствии дитионита натрия в концентрации 0,5 » 4 х10 М и центрифугируют при 1000 g в течение 5 мин. Осадок подсушивают о на холоду и экстрагируют при 6 С в

10 мМ фосфатном буфере рН 7,0, содержащем экстрагирующий агент, указанный

1564190 в первой колонке таблицы (концентрация этого агента указана во второй колонке). После 62 ч зкстракции раствор доводят до l тритона Х-100 и

5 центрифугируют при 2000 g в течение

20.мин. Надосадочную жидкость наносят на колонку с гидроксилапатитом, уравновешенную 10 мМ Na-.ôoñôaòíûè буфером рН 7. Продукты деградации удаляют промыванием колонки 1 0 мИ

Na-фосфатным буфером. Чистые фотосинтетические реакционные центры элюируют 10 мМ Na-фосфатным буфером рН 7, содержащим 0,05Х тритона Х-100. Концентрацию фотосинтетических реакционных центров в исходном материале и конечном продукте определяют с помощью дифференциальной абсорбционной спектроскопии на длине волны 880 нм. 20

Выход продукта рассчитывают по отношению абсолютного содержания фотосинтетических реакционных центров в конечном продукте к таковому в исходном материале. Величины выхода 25 конечного продукта при различных способах экстракции показаны в таблице.

Пример 2. Клетки серных бакте- 0 рий вида Ectothiorhodospira shapochnikovii штамм sp.l или шт. И -1 выращивают фототрофно на среде Ларсена 7

10 дней, собирают центрифугированием, замораживают. Размороженные клетки

35 суспендируют в 10 MN фосфатном буфере рН 7,0, содержащем 10 М этилендиаминтетрауксусной кислоты, озвучи- вают на ультразвуковом диспергаторе

УЗДН-1 при частоте 22 кГц, токе 0,7 А.4

Раствор центрифугируют 30 мин при

10000 g, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость центрифугируют при

144000 g 1 ч. Остальные операции— как в примере 1.

Предложенный способ является более эффективным, так как использова-. ние 60-70Х-ного ацетона (по сравнению с 90 .-ным ацетоном в прототипе), 0,5-1Х-ного: холата натрия (по сравнению с 2 -ным холатом натрия) на стадии экстракции и вместо 27,-ного холата натрия 0,1 - 0;2X-ного тритона К-100 при разделении. белков фотосинтетических реакционных центров на колонке позволяет увеличить выход целевого продукта до 47-55 по сравнению с 15Х в прототипе.

Предложенный способ является более простым, так как в нем отсутствует обработка мембран тритоном Х-100, разделение тритоновых комплексов на колонке с гидроксилапатитом, высаливание тритонового комплекса сульфатом аммония, высаливание фотосинтетических реакционных центров с сульфатом аммония. Количество операций по сравнению с прототипом сокращено с 9 до 5, Целевой продукт сохраняет нативные свойства при получении предложенным способом и является высокоочищенным, что подтверждено данными электрофореза в полиакриламидном геле и абсорбционной спектроскопии.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ получения препарата фотосинтетических реакционных центров, содержащих фотоактивные цитохромы, включающий разрушение клеток пурпурных серных бактерий, отделение и солюбилизацию хроматофоров, высаливание ацетоном фракции, обогащенной продуктом, экстракцию детергентом с последующей хроматографи олеской очисткой на гидроксилапатите и элюцию целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, солшбилизацию и высаливание фракции, обогащенной фотосинтетическими реакционными центрами, осуществляют одновременно, при этом ацетон используют в концентрации 6070Х в присутствии дитионита натрия в концентрации 0,08-0,17 ., экстракцию проводят смесью детергентов с конечными концентрациями тритона Х-)00

0,05 — 0,2 ., холата натрия 0,5-1 и дитионита натрия 0,17-347, а элюцию проводят буферным раствором, содержащим тритон Х-1ОО в концентрации 0,050,2Х.

15641 90 6

Концентрации детергентов, используемых для экстракции целевого продукта

I, Дитионит натрия

Тритон

Х-100

Холат натрия

0,1Х 0

О,ОЗЖ

О,IF

2. Дитионит натрия

Тритон

Х-100

Холат натрия

38+57.

0,173 45%51

0,05Х

0,5Х

3. Дитионит натрия

Тритон

Х-100

Холат натрия

4. Дитионит натрия

Тритон

Х-1 00

Холат натрия

0,34Е 55+5X 4745_#_

0 2Х

1F. 0

Составитель В. Романова

Редактор А. Маковская Техред Л.Олийнык Корректор А. Обруч ар

Заказ 1139 Тираж 476 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, iK-35, .Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101