Способ получения w-интерферона человека
Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения интерферона. Способ получения W - интерферона заключается в том, что трасформированный рекомбинантной плазмидой ДНК-PY-JDB-HUIFNW штамм дрожжей СМЗ-С2 инкубируют, центрифугируют при 5000G в течение 5 мин, суспендируют в растворе гуанидин хлорида, добавляют стеклянные шарики с последующим встряхиванием, надосадочную жидкость инкубируют и объединяют с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим гуанидин хлорид, с последующим центрифугированием при 12000G в течение 1 мин.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 15/00, С 12 Р 21/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H rIATEHTY
Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения интерферона.
Способ получения W- vep@epoaa за-! ключается в том, что трансформированный рекомбинантной плазмидой ДНК рУ JDB-Нц,ЩЩ штамм дрожжей СМЗ-С2 инкубируют, центрифугируют при 5000 g в течение 5 мин, суспендируют в растворе гуанидин хлорида, добавляют стеклянные шарики с последующим встряхиванием, надосадочную жидкость инкубиру- ют и объединяют с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим гуанидин хлорид, с последующим центрифугированием при 12000 g в течение 1 мин.
В примерах 1,2 используют среды следующего состава. YNB+CAA- среда .(1 л), r: >
6,7
19
20 мл), r:
0,25
0,20
Гистидин
Изолейцин
Лизин
Метионин
Фениланилин
Треонин
Аденин
0,10
0,60
0,40
0,10
0,60
0,50
0,12
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21 ) 4355 228/30-1 3 (62) 3935002/28-14 (22) 19.02.88 (23) 31.07.85 (31) Р 34283/06 (32) 01.08.84 (33) DE (46) 15. 03. 90. Ыюл. К 10 . (71) Берингер Ингельгайм Интернацио наль ГмбХ (DE) (72) Рудольф Гауптманн, Петер Мейндль, Эва Растль-Дворкин, Гюнтер Адольф, Петер Светлы, Кристиан Пилер (AT) и Норберт Гауэль (DE) (53) 575.224.2(088.8) 2 ! (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ W-ИНТЕРФЕРОНА
ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения интерферона. Способ получения W-интерферона заключается в том, что трансформированный рекомбинатной плазмндой ДНК=рУ- JDB-Нп.101>11ч штамм дрожжей
СМЗ-С2 инкубируют, центрифугируют при
5000 g в течение 5 мин, суспендируют в растворе гуанидин хлорида, добавляют стеклянные шарики с последующим встряхиванием, надосадочную жидкость инкубируют и объединяют с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим гуанидин хлорид, с последующим центрифугированием при 12000 g в течение 1 мин.
YNB без аминокислот
Кас-аминокислота
Вода
УРД-среда (1 л), r:
Дрожжевой экстракт, г
Вакт-пептон, r
Вода
50 х минус Leu-раствор (100
Триптофан
Аргинин
1551251. Урацил
Вода
Стерильная фильтрация.
Сорбитные пластинки (600 .Сорбит
Глюкоза
YNB
Агар
Вода
0,24 мл), r:
109,2
12,0
:4, 02
Топ-агар (1 л), r:
Сорбит
Глюкоза
YNB
Агар
Вода
Автоклавная обработка.
ЬЕВ (25 мл), мл .
2 И сорбит
0,5 M этилендинитрилотетрауксусная кислота (ЭДТУК)
Дистиллированная вода
ДТТ (дитиотрейтол)
Стерильная фильтрация.
SCE (25 мл), мл .
2 И сорбит
0,5 М цитрат тринатрия
0,5 И ЭДТУК
Стерильная дистиллированная вода
CAS (25 мл), мл;
2 M сорбит
100 мМ хлористый кальций
1 И трис; рН 7,5
Стерильная дистиллированная вода
Раствор ПЭГ (20 мл), мл:
Полиэтиленгликоль с м,в ° 4000„ ã
100 мМ хлористый кальций
1 М трис; рН 7,5
Дистиллированная вода
182
7 20
12,3
1,25
11, 25
192,75 30
12,5
5,0
0,5 35
12,5
2,5
0,25
9,75
2
02 50
17,8
Стерильная фильтрация
S0G (5.мл), мл:
2 И сорбит
УРД
100 мИ хлористый кальций
1,7
0,3
Обрабатывают в автоклаве и охлаждают до 45 С, = àòåì добавляют 50 х минус Leu-раствора и изготовляют пластинки. 15
50 х минус Leu-раствор, мкл 12,5
Дистиллированная вода 0,5
Стерильная фильтрация.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1, Конструирование плаэмиды pY- JDB-}ШЛРИЫ1 .
l.
А. Получение фрагмента промотора
ADHI.
80 мкг плазмиды рЕЯ 103 переваривают с ВатНТ и XhoI эндонуклеазами в 500 мкл раствора. Промотор длиной около 1400 пар оснований (п,о.) отделяют от вектора на 1%-ном агаровом геле, выделяют из геля электроизоляцией и осаждают, Фрагмент поглощают в 40 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис, 1 мМ
ЕДТУК, рН=8), Б. Подготовка вектора pJDB 207.
10 мкг известной плазмиды pJDB 207 разрезают с помощью BamHI в 100 мкл раствора, линеаризуя ее. С целью предотвращения последующей религации
5 -концевые фосфатные группы удаляют путем обработки фосфатазой телячьего кишечника. Линейную форму отделяют на 17-ном агаровом геле от неразрезанной плазмиды, выделяют электроэлюацией и осаждают. Векторную ДНК растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера.
50 мкл плазмиды pRHW 12 линеаризуют с uoMorqf e Hind III в б00 мкл раствора. Путем добавления фрагмента
Кленова ДНК-полимеразы 1 (10 единиц) и четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (по 25 мкм) и инкубации при ком1 натной температуре 5 -выступающие концы превращают в прямые концы. Линейную форму плазмиды очищают путем электрофореза на агаровом геле и последующего выделения. Фрагмент растворяют в 50 мкл ТЕ-буфера. Для получения соединяющихся с фрагментом прототора концов к концам линейного pRHW 12 . присоединяют Xho 1-линкеры, для чего
3 мкл Xho 1-линкера (формула
d)CCTCGAGG)) фосфорилируют 5 ед. 14полинуклеотидкиназы и гАТР; после инактивации энзима нагреванием в течение 10 мин при 70 С 5 мкл этого раствора объединяют с 10 мкл линейной формы плазмиды pRHW 12; 20 мкл реакционного раствора лигируют с Т4-ДНК-лигазой7 (1б ч при.14 С). Лигазу инактивируют путем обработки в течение 10 мин при о
70 С и доводят объем реакционного раствора до 150 мкл добавлением буфе51251 6
5 15 ра А (10 mM трис, рН=7,6, 50 мИ хлористого натрия, 1О мИ хлористого магния).
Путем обработки 100 ед. XhoI ураляют специфичные относительно XhoI
5 -выступы. Сцабженную XhoI-концами линейную плазмиду pRHW 12 очищают пу-. тем электрофореза на агаровом геле и электроэлюации из геля, Перед осаждением добавляют 5 мкл фрагмента промотора. После осаждения молекулы ДНК поглощают в 14,5 мкл TE-буфера и после добавления буфера лигирования и
5 ед. Т4-ДНК-лигазы лигируют в течео ние 16 ч при 14 С. После термической инактивации энзима объем раствора доводят до 200 мкл добавлением упомянутого вьппе буфера А и режут ДНК с помощью ВашНХ. Желаемую ДНК получают очисткой агаровым гелем и растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера.
Готовую плазмиду получают лигированием 5 мкл фрагмента BamHI (промотор и ген интерферона W1) с 1 мкл линеаризованного вектора pJDB B207 в 10 мкл раствора в присутствии 1 ед.
Т4-ДНК-лигазы.
10 мкл компенентных клеток штамма
E.coli НВ 101 трансформируют путем добавления 5 мкл раствора продукта лигирования и культивируют на LB-агаровых пластинках, содержащих
f00 мкг/мл ампициллина.
Произвольно выбирают 12 из полученных клонов и .выделяют содержащиеся в них плазмиды в малом масштабе (объем культуры 1,5 мл). После обработки этих плазмид с помощью различных рестрикционных энзимов и электроI
Cepesa на агаровом геле выбирают плазмиду, имеющую желаемую конструкцию, и обозначают ее как pY-JDB-Hu-JFNW1.
Пример 2. Получение W-интерферон а.
А. Трансформация дрожжей..
25 мл УРД + минус Leu-раствора инокулируют дрожжевой колонией (штамм ЖЗ-С2). Культуре дают расти в течение ночи при 30 С. 100 мл УРД++минус Leu-раствора инокулируют
100 мкл полученной предварительной о культуры и дают расти при 30 С до оптической плотности 1 при 600 нм (около 4х10 клеток/мл). Дрожжевые клет,ки удаляют центрифугированием (в течение 5 мин при 5000 об,/мин). Клетки повторно суспендируют в 10 мл
SED и инкубируют в течение 10 мин при 30ОС. Клетки еще раз центрифУгируют (в течение 6 мин при 2500 об. /мин) и повторно суспендируют в 10 мл SCF..
Затем добавляют 100 мкл глузулазы (р-глукоронидазы, арилсульфатазы) и инкубируют в течение 30 мин при 30 С.
При этом получают сферобласты, 10 которые отделяют центрифугированием (5 мин при 2000 об./мин) с последующей промывкой GAS и повторным суспендированием в 500 мкл GAS.
120 мкл сферобластов смешивают
15 с 6 мкг плазмидной ДНК (pY-JDB-HuJFNW1) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. После добавления 1 мл раствора ПЭГ инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем клетки отделяют цент20 рифугированием (5 мин при 2000 об. /мин) °
Клетки повторно суспендируют в 150 мкл
S0G-раствора и инкубируют в течение
30 мин при 30 С. Затем добавляют
5 мл Топ-arapa + 250 мкл 50 х минус
Leu-раствора и наносят клетки íà сорбитные пластинки. По истечении 24 дней инкубации при 30 С развиваются колонии
Б. Получение интерферона.
25 мл YNB + САА среды + 1 мл
50/-ной глюкозы + 1 мл 50 х минус
Leu-раствора инокулируют трансформированной дрожжевой колонией. Продолжительность инкубации составляет по меньшей мере 40 ч при 30 С. 13 мл этой культуры центрифугируют в тече.ние 5 мин при 4500 об./мин. Центрифугат суспендируют в 0,5 мл 2И гуанидин хлорида и после добавления 2 мл стеклянных шариков (диаметр 0,40,5 мм) интенсивно встряхивают в тео чение 10 мин при 4 С. Затем надосадоч" ную жидкость переливают в другую о
4g емкость и инкубируют при О С. Стеклянные шарики промывают 0,5 мл 7 M гуанидин хлорида и объединяют полученный раствер с надосадочной жидкостью„
; Раствор центрифугируют в течение !
1 мин при 12000 об. /мин, Надосадочная жидкость содержит 1x10 ед.
ЛРК41/л дрожжевой культуры.
Пример 3, А, Повторяют пример 1 с той лишь разницей, что вместо плазмиды pRHW 12 используют плазмиду pRHW 11, вместо плазмиды р9А2 используют плаэмиду Е76Е9. При этом получают экспрессионный вектор pY-JDBHuJFNW2.
155125
Фо рмула из об ре те н ия
Способ получения N-интерферона человека, включающий трансформацию штамма Saccharomyces cercvisial
СИЗ-С2 рекомбинантной плазмидой ДНКpY-JDB-HuJFNM, инкубацию трансформированных клеток, разрушение клеточных стенок центрифугированием при
5000 g в течение 5 мин, суспендирование в 2 N гуанидин хлориде,: добавление стеклянных шариков с последующим встряхиванием; инкубацию надосадочной жидкости и объединение с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим 7 М гуанидин хлорида, с послерующим центрифугированием при
12000 g в течение 1 мин.
Составитель Н. Кузенкова
Редактор A,Ìàêoâcêaÿ Техред М,Ходанич Корректор С.Шевкун
Заказ 280 Тираж 496 Подписное
ВН1ИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, д. 4/5
Производственно-издательский комбичат "Патент", r.yæãîðîä, ул. Гагарина,101
Б, Повторяют пример 2 с той лишь разницей, что трансформацию дрожжей
Осуществляют с использованием экспрессионного вектора pY- JDB-HuJFNM2.
При этом получают 1х10 ед. интерфе фона М2.
JFNM2 отличается от JFNW1 лишь за. меной кодирующего Ш-ю аминокислоту кодона GGG на кодон GAG (кодирующий
Глутаминовую кислоту).
II р и и е р 4, Опыты по определейию антивирусной активности.
A. Ачтивирусная активность на человеческие клетки.
Линия клеток: человеческая линия клеток рака легкого А549/ (АТСС CCL
185) .
Вирус: мышиный вирус энцефаломиокардита.
Тест-система: подавление цитопатического эффекта (все титрования осуществлялись четырехкратно), 25
Интерферон по примерам 2 и 3 титРуют в пригодном разбавлении в указанной тест-системе„Препарат пока-. зывает ярко выраженную антивирусную активность при удельной активности
8300 международных частиц/мг в расчеТе на стандарт (Go-23-901-527) . ИзВестные человеческие интерфероны тиПа Ы, р и . показывают такую же антиВирусную активность только при удельНой активности 8700, 9000 и 8800 меж- 35 ,Цународных единиц/мг соответственно.
Б. Лнтипролиферативная активность
Йа человеческие клетки, Человеческую линию клеток Daudi выращивают в присутствии человеческо40 го интерферона по примерам 2 и 3 и
1 8 известных человеческих интерферонов типа о(, / и у, которые использовались в различных концентрациях, Через шесть дней инкубации при 37 С определяют плотность клеток. Необработанные культуры служат в качестве контроля. Все культуры приготавливают трехкратно и испытывают параллельно. При этом обнаружено, что ярко выраженное подавление пролиферации клеток обеспечивает интерферон примеров 2,3 в количестве 100 международных единиц, а интерфероны типов 4> р и g- в количестве 110,125 и 130 международных единиц соответственно.
Сравнение результатов опытов А и Б свидетельствует о том, что новый
M-интерферон проявляет ту же антивирусную активность, что и известные интерфероны типов,o(, /Ь и g, но при меньшей концентрации, т.Е. он обладает лучшей антивирусной активностью,
