Способ микроклонального размножения лиственницы

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микроклональному размножению ценных пород деревьев, и может применяться в лесном хозяйстве. Целью изобретения является повышение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения. Способ состоит в том, что в культуру вводят зимние апикальные почки диаметром не менее 3 мм и последующее культивирование осуществляют в три этапа, при этом используют среды Литвей и Соммера со специфическими фитогормонными добавками. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

В (21) 4472701/31-13 (22) 10.08.88 (46) 15.06.90. Бюл. N 22 (71) Отдел биохимии и цитохимии Башкирского филиала АН СССР (72) В.П,Путенихин и P.К,Байбурина (53) 578.085.23 (088.8) (56) Organogenesis in vitro of tissues from

mature conifers, In vitro. - Bonga J.M.: 1981, ч. 17, ¹ 6, р. 511-518. (54) СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЛИСТВЕННИЦЫ

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к проблеме клонального микроразмножения лесных древесных растений для воспроизводства ценных хвойных пород в лесном хозяйстве.

Целью изобретения является увеличение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения.

Способ состоит в том, что в качестве исходных эксплантатов используют покоящиеся (зимние) апикальные почки не менее

3 мм в диаметре, которые вводят в среду

Литвей с добавлением 0,5-1,5 мг/л 6-БАП и

0,5-2,0 мг/л кинетина (среда 1) для инициации пазушных почек, после чего диски с пазушными почками переносят на. лишенную фитогормонов среду Соммера (среда 2) для формирования конгломерата пазушных побегов с последующим разделением и субкультивированием на той же среде с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей, содержащей 20-50 мг/л мочевины Ы,, 1571064 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микроклональному размножению ценных пород деревьев, и может применяться в лесном хозяйстве. Целью изобретения является повышение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения. Способ состоит в том, что в культуру вводят зимние апикальные почки диаметром не менее 3 мм и последующее культивирование осуществляют в три этапа, при этом используют среды Литвей и

Соммера со специфическими фитогормонными добавками. 5 табл. (среда 3), для стимуляции удлинения побеговв.

Способ осуществляется следующим образом.

С одревесневших годичных побегов срезают черенки длиной 10-15 см, несущие апикальную почку диаметром не менее 3 мм. Сбор материала проводят в период с октября по апрель. Возможность хранения одревесневших черенков в течение длительного времени под снегом, а также в холодильных камерах обеспечивает круглогодичное проведение работ, Верхушечные части черенков отрезают, обмывают в слабом мыльном растворе и прополаскивают в проточной воде. Подго: товленный таким образом материал стерилизуют сначала в течение 2 мин в 70; -ном водном растворе этилового спирта, затем 15 мин в 5 -ном водном растворе гипохлорита кальция и трижды промывают стерильной дистиллированной водой. В стерильных условиях (шкафу с ламинарным течением воз1571064

15

30

45

55 духа) удаляют покровные чешуи с верхушечной почки и выделяют зачаточный побег, несущий меристему и листовые примордии.

Изолированные эксплантаты помещают на агаровую питательную среду 1 в биологические пробирки или колбы. Среда 1 содержит минеральные соли, витамины, мезоинозит, а также 2% сахарозы, 0,6% агара и гормональные вещества: B-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 0,5-1,5 мг/л и кинетин

0,5-2 мг/л (табл.1). B течение 4-7 недель на этой среде (у 53-81% эксплантатов) происходит инициация пазушных почек, что выражается в набухании исходной почки, разрастании ее в ширину и образовании светло-зеленого диска диаметром до 10 мм, Полученные таким образом диски переносят на питательную среду 2, представляющую собой модифицированную по минеральному составу среду Соммера, лишенную регуляторов роста (табл,1), На этой среде в течение 4-5 недель происходит рост инициированных пазушных почек с образованием конгломерата коротких побегов длиной 1-3 мм (в среднем 16,7 побегов на 1 эксплантат), Сформированный конгломерат разделяют под микроскопом и каждый побег помещают на среду 3, являющуюся дилюированной вдвое по минеральному составу средой 2, к которой добавлена мочевина в концентрации 20-50 мг/л (табл.1).

На этой среде происходит удлинение побегов, которые в течение 4-7 недель достигают длины 6-10 мм. Полученные таким образом побеги морфологически пригодны для стимуляции ризогенеза на укоренительных средах. Процесс клонирования составляет

85-130 дней от момента введения эксплантатов в культуру до получения удлиненных побегов.

8 табл,1 представлены среды, используемые для клональной мультипликации лиственницы в культуре изолированных вегетативных почек! и vitro, Пример 1; Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в 3 срока: ноябре, феврале, апреле с 20-23-летних деревьев лиственницы Сукачева различного географического происхождения (30 клонов). Часть черенков, собранных в ноябре и феврале, находится под снегом (5 мес) и в холодильнике при 3 С (2 мес), после чего их используют для взятия эксплантатов, Наиболее крупные апикальные почки (5-6 мм) после стерилизации и удаления покровных чешуй культивируют последовательно на питательных средах 1, 2 и 3 со следующими оптимальными концентрациями добавок: БАП 1,0 мг/л, кинетин 1,0 мг/л. мочевина 30 мг/л. Культуры выращивают на светоплощадке при 16-часовом фотопериоде (освещение люминесцентными лампами

2000-500 лк) при 26 С днем и 22 С ночью

Продолжительность культивирования на каждой из сред варьируют в зависимости от клонов от 4 до 6 недель, Различия в характере мультипликации в зависимости от сроков взятия и продолжительности хранения черенков не являются существенными (табл.2). Средняя эффективность образования дисков с пазушными почками (инициация пазушных меристем) 75%, среднее число побегов на 1 эксплантат 18,7, а максимальное 25, средняя длина побегов после удлинения 8,4 мм. Продолжительность процесса мультипликации 12-17 недель.

Пример 2. Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в ноябре и апреле с 20-23-летних деревьев (20 клонов), Апикальные почки распределяют на 3 группы по их размерам; мелкие(1-2 мм), средние (3-4 мм) и наиболее крупные (5-6 мм), затем культивируют отдельно при тех же условиях, что в примере 1. Результаты приведены в табл.3.

Таким образом, для культивирования целесообразно использовать почки размером не менее 3 мм.

Пример 3. Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в ноябре, феврале с 20-летних деревьев (20 клонов). Культуры почек выращивают на среде

1 с различными концентрациями гормональных веществ. В ходе экспериментов установлены предельные значения и оптимальные концентрации БАП и кинетина, Результаты представлены в табл.4 и 5 соответственно.

Пример 4. Растительный материал, как в примере 1. После культивирования на средах 1 и 2 полученные множественные микропобеги отделяют и субкультивируют индивидуально на среде 3 с различными концентрациями мочевины с целью удлинения. Экспериментально определены предельные значения и оптимальные концентрации мочевины. Результаты представлены ниже.

Концентрация мо- Средняя длина чевины, мг/л побегов,мм

20 6,1

30 8,4

50 5,7

Пример 5. Черенки длиной 10 см заготавливают путем отстрела в 100-летних естествен н ых насаждениях лиственницы

Сукачева, принадлежащих к двум популяциям (20 клонов). Через 5 дней после сбора апикальные почки диаметром 3-4 мм вводят в культуру (после удаления покровных че1571064 шуй) и выращивают последовательно на питательных средах 1-3 с оптимальными концентрациями добавок: БАП 1,0 мг/л, кинетин 1,0 мг/л, мочевина 30,0 мг/л, Культуры помещают в термосветоклиматокамеру при тех же условиях, что в примере 1, но освещенность поддерживают на уровне

25000 лк, Эффективность образования дисков варьирует между клонами и составляет в среднем 55, число формирующихся побегов изменяется от 13 до 14, а в среднем

8,3, средняя длина побегов к концу удлинения 6,2 мм. Продолжительность процесса мультипликации 16-18 недель.

Преимуществами изобретения являются: возможность микроклонирования взрослых элитных деревьев лиственницы (до 100 лет включительно), относящейся к числу наиболее ценных трудноразмножаемых хвойных пород; идентичность растений-регенерантов и донорского дерева по генотипу вследствие мультипликации. через пазушное побегообразование; высокая степень мультипликации (до 25 побегов на эксплантат), ранее достигаемая только на лиственных древесных породах; эффективное удлинение побегов (до 6-10 мм); п ростота подготовки и хранения растительного материала перед введением в культуру (отсутствие гормональной и прочей обработки); быстрота процесса, занимающего от момента введения эксплантгтов в культуру до получения удлиненных побегов 85-130 дней; возможность круглогодичного проведения работ, 5

Формула изобретения

Способ микроклонального размножения лиственницы, включающий посадку эксплантатов на питательную среду, 10 культивирование, получение регенерантов и адаптацию их к условиям открытого грунта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода размножаемых растений и ускорения процесса размножения, в

15 качестве эксплантатов используют покоящиеся апикальные почки диаметром 3 мм и более, а культивирование осуществляют в три этапа. при этом на первом этапе — инициации морфогенеза пазушных почек—

20 культивирование ведут на среде Литвей, в которую вводят дополнительно 6-бензиламинопурин в количестве 0,5-1,5 мг/л, и кинетин, в количестве 0,5/2,0 мг/л; на втором этапе — формирование пазушных побегов—

25 культивирование ведут на среде Соммера без фитогормонов, на третьем этапе — удлинение побегов — культивирование ведут на среде Соммера с уменьшенным вдвое количеством минеральных солей, в которую до30 полнительно вносят мочевину в количестве

20-50 мг/л, Таблица 1

Состав среды*

1 (по Литвей ) 2 (по Соммеру), моди3 (по Соммеру), модии и ованная и и ованная

1650,0

1900.0

1850,0

340,0

22,0

7,8

37,3

4,15

31,0

21,0

43,00

0,50

1,25

0,13

100,0

20000,0

0,5

0,1

0,1

ИН4ИОЗ

КМОз

MgSO4 7Н20

КН2Р04

СаС1 г 2Н20 (Й Н4)2504

KCI

i×àH2ÐO4 Н20

FeSO4 7НгО

КагЕДТА 2Н20

KI

НзВОз

МпЯО4Н20

ZnSO4 7Н20

Си SO4 5H20 йа2Мо04 2Н О

CoClz 6Н20

Мезоинозит

Сахароза

Никотиновая кислота

Пиридоксин — НС!

Тиамин — H Cl

Соде жание в с е е, мг/л

1000,0

250,0

150,0

200,0

300,0

180,0

27,8

37,3

0,75

3,0

10,0

3,0

0,25

0,25

0,25

10,0

20000,0

0,1

0,1

1,0

500,0

125,0

75,0 I 00,0

150,0

90,0

13,9

18,65

0,37

1.5

5,0

1,5

0,12

0,12

0.12

10,0

20000,0

0,1

0,1

1,0

1571064

Продолжение табл.1 рН 5,6 — 5, Таблица 2

Продолжение табл.2 культуру эксплантатов, выраженное в 7,, Таблица 3

Таблица 4 р и м е 4 э н и е: Концентрация кинетина во всех вариантах

1 мг/.л.

1571064

Таблица 5

Составитель В,Демкин

Редактор О.Спесивых Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н.Ревская

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1487 Тираж 486 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5