Способ получения биомассы возбудителя малярии рlаsмоdiuм fаlсiраruм

 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к паразитологии. Цель изобретения - повышение выхода биомассы возбудителя малярии PLASMODIUM FALCIPARUM. При пропускании суспензии эритроцитов через колонку-капилляр лизируются те клетки, которые являются непригодными для культивирования паразитов. Отличительным признаком способа является снижение гематокрита клеточной суспензии с 10 (до пропускания) до 6-8% (после пропускания). Оптимальное число пропусканий через колонку 20-25 раз. При соблюдении этих условий и последующем пересеве со свежими эритроцитами наблюдаются значительная стимуляция роста паразитов в культуре и увеличение выхода биомассы возбудителя малярии. 1 табл.

СОКИ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) О А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ф \

М °

° °

° е

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4372255/30-13 (22) 02.02.88 (46) 1 5. 05. 90. Бюл. Р 18 (71) Институт медицинской. паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского (72) А. И. Аллахвердиев и JI. Н. Гринберг (53) 616.936(088.8) (56) Трейджер У., Дженсен Дж. Бюль.

ВОЗ, Т. 55, ч. 11, 1978, Р 2-3, с. 371 -373. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ. ВОЗБУ,ДИТЕЛЯ МАЛЯРИИ PLASMODIUM РАСС?РАКОМ (57) Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к паразитологии.

Цель изобретения — повышение выхода

Изобретение относится к биалогии и медицине, а именно к паразитологии.

Цель изобретения — повышение выхода биомассы возбудителя малярии

P. falciparum.

Изобретение основано на методе частых пересевов со свежими отмытьии эритроцитами.

Используют 50Х-ную суспензию эритроцитов человека. 5 — 10 мл крови человека переносят в, стерильные центрифужйые пробирки и центрифуГируют при

2000 об/мин в течение 5 - 10 мин.

-Плазму и лейкоцитарный слой удаляют пипеткой, а осажденные клетки ресуспендируют в равном объеме.ЯРЦ1-1640-без сыворотки с исходным рН 7,2.—

7„3. Затем еще дважды центри} угируют и удаляют надосадочную жидкость. Клетки суспеидируют B равном объеме (gI)5 А 61 K 39/02, С 12 N 5/00 биомассы возбудителя малярии Plasmodium falciparum. При пропускании суспензии эритроцитов через колонку-капилляр лизируются те клетки, которые являются непригодными для культивирования паразитов. Отличительным признаком способа является снижение гематокрита клеточной суспензии с 10 (до пропускания) до 6 — B (после пропускания}. Оптимальное число пропусканий через колонку 20 — 25 раз. При соблюдении этих условий и последующем пересеве со свежими эритроцитами наблюдаются значительная стимуляция роста паразитов в культуре и увеличение выхода биомассы возбудителя маля- а рии. 1 табл.

IFHI-1640 с 10Х-ной сывороткой соответствующей группы. Таким образом, получают 50Х-кую суспензию эритроцитов. Культуральные клетки переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 3-4 мин со скоростью

1000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают, к осажденным эритроцитам добавляют равный объем полной питательной среды и получают 50Х-ную суспенэию клеток. После тщательного переменивания в стерильных условиях к суспензии эритроцитов из культуры добавляют 50Х-ную суспензию свежих отиытых эритроцитов, чтобы конечная паразитемия была 0;3 — 0,5Х. Затем, чтобы получить 10Х-ную клеточную суспензию, прибавляют полную питательную среду КРИ1-1640, НЕРЕЯ (25 ммоль/л)

+ 10X сыворотки + 5X Na CO, рН 7,2.

1563700

Суспензию тщательно перемешивают пастеровской пипеткой, разливают в куль-. ,туральные чашки по 1,5 мл в каждую и продолжают культивирование. Оценку результатов производят в тонких мазках, подсчитывают паразитов íà 1000 эритроцитов и выражают в процентах.

При культивировании молярийных паразитов при высокой паразитемии, отсУтст- 10 вии смены среды и т,д. происходит ухудшение состояния культуры: задерж ка роста и размножения паразитов. !

Для коррекции этих неблагоприятных изменений обычно. используют способ частых пересевов, однако положитель.:ный эффект, т.е. стимуляция роста паразитов, наблюдается примерно в 50% случаев (в зависимости от исходного

;состояния паразитов).. Присутствие хрупких эритроцитов, находящихся в предгемолитическом состоянии и не ( пригодных для развития в них парази тов, препятствует эффективному куль:тивированию. 25

Согласно предлагаемому способуэритроциты пропускают через колонкукапилляр с последующим замещением, разрушенных клеток свежими эритроцитами. Использу от культуру, в которой наблюдается замедленное развитие па-. разитов и встречаются патологические формы возбудителя, Клетки переносят в центрифужную пробирку и затем пропускают через стеклянную колонку-капилляр длиной 300-350 мкм, имеющую 6 — 8 сужений капиллярного диаметра 80 — 100 мкм.

Отверстия меньшего диаметра не пропускают суспензию, отверстия большего 40 диаметра пропускают клетки свободно, не вызывая лизиса. Толщина колонки

5 — 8 мм определяется требованиями технической прочности изделия.

Число пропусканий, необходимое для удаления хрупких эритроцитов из культуры, подбирают для конкретных условий. При этом исходят чз показателей гематркрита суспензии до и после пропускания. Гематокрит — отноше-;. ние объема (упакованных) интактнык эритроцитов к объему всей суспензии— определяют центрифугированием в узком капилляре.

Снижение величины гематокрита по мере пропускания клеток через колонку указывает на лнзис эритроцитов.

Для стандартных условий культивирования (гематокрит суспензии в культуре. составляет 10%) используют 20 — 25кратное пропускание клеток через колонку с шестью капиллярными сужениями е

П р и м е p ° Из четырех культуральных чашек сливают содержимое в стерильную пробирку и перемешивают, Определяют гематокрит полученной суспензии, Колонку предварительно стерилизуют, промывают средой и высушивают. С помощью большого шприца создают отрицательное давление и пропускают суспензию через колонку. Пропускание повторяют 10 раз, после чего определяют гематокрит конечной суспензии. Если он снижается до 6 — 8%, то обработку останавливают. В противном случае пропускают еще 5 раз и снова измеряют гематокрит, т.е. устанавливают зависимость конечного гематокрита от числа пропусканий . В дальнейшей работе пропускают суспензию фиксированное число раз без определения гематокрита.

Пропускают через колонку 15 раз (А) суспензию с гематокритом 10% гематокрит конечной суспензии не изменяется и составляет 10% (см. таблицу). При пересеве этих клеток со свежими эритроцитами подсчитывают паразитемию. Заметного размножения паразитов через 48 ч не происходит. Пропускают суспензию через коланку

20 раз — конечный гематокрит снижает ся до 8%. При пересеве этих клеток со свежими эритроцитами подсчитывают паразитемию. Рост паразитемии увеличивается в 6,6 раза (Б). Пропускают суспензию через колонку 25 раз, Рост паразитемии увеличивается в 4 раза.

Конечный гематокрит снижается до .6% (В).

Пропускают суспензию через колонку 30 раз, происходит лизис зараженных эриФроцитов (Г).

Таким образом, эффект последующей стимуляции размножения возбудителя в культуре достигается при 2i5 — 25-: кратных пропусканиях через колонку, при этом гематокрит суспензии снижается на 2 — 4%. Дальнейшее снижение гематокрита нецелесообразно, так как остается слишком мало клеток для пересева и, кроме того, начинают разрушаться эритроциты, содержащие возбудителей.

1563700

Ю

Число паразитов/1000 эритроцитов

Гематокрит, 7.

Число

Процесс пропу сканий после обработки через 48 ч и пересева до пропус- после прокания пускания

8 12

9 58

7 43

Лизис зараженных эритроцитов

1О

А

Б

В

10

Составитель С. Пылова

Редактор М. Петрова Техред Л.Олийнык Корректор Т. Палий

Заказ 1115 Тираж 546 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

После обработки суспензию центрифугируют, удаляют надосадок. К осадку приливают 5-кратный объем полной питательной среды. Затем центрифугируют, отбирают надосадочную жидкость.—

К осадку добавляют 5-кратный объем полной питательной среды и центрифугируют в течение 3 мин со скоростью

1000 об/мин. Отмывание повторяют до удаления следов гемолиза.

После удаления надосадочной жидкости в пробирке остается 0,3 мл клеток . Далее, чтобы получить 50Х-ную суспензию, к осадку добавляют равный объем полной питательной среды. Тщательно перемешивают и готовят мазок, красят по Романовскому-Гимза и подсчитывают наразитемию.

Выход биомассы (т.е. количество паразитов на 1000 эритроцитов) значи— тельно выше (R 4-5 раз) при включегпиг предлагаемого способа в процессе культивирования.

Формула изобретения

Способ получения биомассы возбудителя малярии Plasmodium falciparum, 1g включающий получение суспензии -зараженных эритроцитов, культивирование возбудителя в питательной среде путем пересевов с добавлением свежих эритроцитов, отличающийся

15 тем, что, с целью повышения выхода биомассы возбудителя, перед пересевом суспензию эритроцитов продавливают через колонку с микрокапиллярными су спензиями, пропускающими эритроциты до получения 6-8К суспензии эритроцитов.