Способ определения изоэлектрической точки белка

 

Изобретение относится к молекулярной биофизике и предназначено для измерения характеристик белков-протеинов. Цель изобретения - повышение чувствительности и точности определения изоэлектрической точки белков-протеинов. Для этого облучают среду, содержащую макромолекулы, поляризованным оптическим излучением, регистрируют поляризованную и деполяризованную компоненты рассеянного света при различных PH среды и различных концентрациях раствора белка, затем определяют зависимость коэффициента деполяризации, экстраполированного к нулевой концентрации белка, от PH раствора, по положению экстремума этой зависимости находят значения PH, соответствующие изоэлектрической точке белка. 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (11). (51)э G 01 N 21/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4457131/31-25 (22) 01,06.88 (46) 15.07.90, Бюл, У 26 (71) ИГУ им. M.Â.Ëîìoíoñoâà (72) Г.П,Петрова и Ю.М.Петрусевич (53) 535.511.(088.8) (56) Нейрат Г., Бейль К. Белки. Издво Иностранная литература, 1956, гл.7.

Тенфорд Ч, Физическая химия полимеров. М.: Изд-во Химия, 1965, с,470492. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ БЕЛЦА (57) Изобретение относится к молекулярной биофизике и предназначено для измерения характеристик белков-протеиИзобретение относится к молекулярной биофизике и предназначено для измерения характеристик белков-протеинов, а именно их изоэлектрических точек.

Целью изобретения. является повьппение чувствительности и точности определения изоэлектрической точки белков.

Сущность способа заключается в следующем. ,Облучают среду, содержащую макромолекулы поляризованным оптическим излучением, регистрируют поляризованную (T ) и деполяризованную (Т „) компоненты рассеянного света при различных рН среды и различных концентрациях раствора белка (С), затем определяют зависимость коэффициента деполяризации (Llq), экстраполяризованного к нулевой концентрации белка, 2 нов. Цель изобретения — повышение чувствительно(..ти и точности определения изоэлектрической точки белковпротеинов ° Для этого облучают среду,,содержащую макромолекулы, поляризованным оптическим излучением, регистрируют поляризованную и деполяризованную компоненты рассеянного света при различных рН среды и различных концентрациях раствора белка затем определяют зависимость коэффициента деполяризации, экстраполированного к нулевой концентрации белка, от рН раствора, по положению экстремума этой зависимости находят значения рН, соответствующие изоэлектрической точке белка. 1 ил.

V от рН раствора и по положению экстремума этой зависимости находят значения рН, соответствующие изоэлектрической точке белка.

На чертеже представлены графики зависимости коэффициентов деполяризации от рН раствора для водных растворов Х-глобулина и сывороточного альбумина (НБА). Из приведенных экспериментальных зависимостей видно, что для альбумина (1) экстремум зависимости коэффициента деполяризации от pH соответствует рН=4,7, а для Х-глобулина (2) — рН 6,1.

Способ осуществляют следующим образом.

Приготавливают серию образцов растворов исследуемых белков в стандартных стеклянных кюветах с уменьшающейся концентрацией (исходные значения

1578597 концентраций не более нескольких 7) и различными значениями рН раствора.

На установке, предназначенной для измерения интенсивности поляризованного и деполяризованного излучения, с лазерным источником света, фотоэлектрической регистрацией и поляризационным устройством (призмы Волластона и Глана-Томсона) производят измерения поляризованной и деполяризованной компонент света, рассеянного от образцов белковых растворов под углом регистрации -90 . Строят график зависимости отношения интенсивностей деполяризованной (1 ) и поляризованной (I ) компонент от концентрации белка (С) и рН раствора, Положение экстремума этой .зависимости (g =

=f(pH) при С -» 0 определяет значение рН соответствующее иэоэлектрической точке белка, 4

Падающая на рассеивающую среду монохроматическая световая волна Е= (Ж

=Е .е " индуцирует в молекуле пере- д5 менный дипольный момент p=elE, где (— поляризуемость молекулы, Для совершенно изотропных молекул О(является скаляром, и основной вклад в интенсивность рассеянного излучения в раство- З рах макромолекул дает рассеяние на флуктуациях концентрации.

В общем случае, когда рассеивающий объем обладает оптической анизотропией, поляризуемость определяет соотношение величин.и ориентаций в пространстве двух векторов — найряженности электрического поля Е и индуцированного дипольного момента р, It опи.сывается тензором второго ранга, называемым тензором поляризуемости.

Если падающий и рассеянный лучи лежат в горизонтальной плоскости и о составляют угол 90, причем падающий луч поляризован в вертикальной плоскости, флуктуации ориентаций оптической анизотропии молекул приведут к появ лению в рассеянном излучении горизонтальной поляризованной составляющей, Отношение интенсивности деполяризо" ванной и поляризованной составляющих рассеянного излучения называется коэффициентом деполяризации. и =Т /Iq, где Т. р и I q — горизонтально и вертикально поляризованные компоненты рас. сеянного излучения. Зарядовые свой- 5 ства поверхности макромолекул белков определяют их электронную поляризуемость, которая является основным физическим,параметром в явлении рэлеевского рассеяния. При перезарядке молекул с изменением рН среды резко возрастает интенсивность рассеянного света, связанного с флуктуациями концентрации растворов. При этом должны изменяться и поляризованные характеристики среды, связанные с флуктуациями ориентации аниэотропных молекул.

Различный знак производной приведенных на чертеже зависимостей для альбумина и у-глобулина может быть объяснен различием в распределении электронной плотности у поверхностных групп белковых макромолекул.

Таким образом, предлагаемый способ отличается от прототипа пбвьппенной чувствительностью, а также более высохой точностью определения изоэлектрической точки белка.

При осуществлении данного способа могут быть использованы стандартные установки, применяющиеся для измерения интенсивности рассеянного света, требуется очень малое количество исходного вещества, не требуется использования охлаждающей системы, падающее . на среду излучение не вносит возмущения и не изменяет параметров белка.

Формула изобретения

Способ определения изоэлектрической точки белка, основанный на измерении рН среды,. содержащей белковые макромолекулы, о т л и ч а ю. шийся тем, что, с целью повьппения чувствительности и точности определения, облучают среду, содержащую белковые макромолекулы, поляризованным оптическим излучением, регистрируют поляризованную и деполяризованную компонен" ты рассеянного света при различных рН среды и различных концентрациях раствора белка, затем определяют зависимость коэффициента деполяризации, экстраполяризованного к нулевой концентрации белка, от. рН раствора.и по положению экстремума этой зависимости находят значение рН, соответствующее а изоэлектрической точке белка.

1578597

М

С-О

006

005

003 оог

1 3 5 7 0 1f рЯ

Составитель А.Грузинцев

Редактор А,Лежнина Техред М.Ходанич . Корректор Л.Патай

Подписное

Тираж 512

Заказ 1912

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101