Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона африканской зеленой мартышки для размножения вирусов

 

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и касается получения нового штамма гетероплоидных клеток из кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 4921, изучение его свойств, аттестации в качестве безопасного клеточного субстрата и оценки пригодности для применения в вирусологической практике, в том числе и вакцинном производстве. Цель изобретения - установление нового отечественного штамма перевиваемых клеток кожи и мышц эмбриона африканской зеленой мартышки с неограниченым количеством субкультивирований. Штамм 4921 установлен из штамма диплоидных клеток 4921Д. В качестве среды роста применена среда Игла МЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Штамм 4921 гетероплоидный обладает устойчивыми биологическими и морфологическими свойствами, видовая принадлежность подтверждена кариологическим анализом. Создан банк посевных клеток на уровне 42 пассажа. Он состоит из 286 ампул, содержащих 6 .10 6 клеток в каждой, и отконтролирован на безопасность. Кроме того, имеется 6 млрд.клеток на различных уровнях пассажей, заложенных в крупногабаритные контейнеры. Штамм свободен от посторонних агентов - микробов, грибов, вирусов, микоплазм, не онкогенен. Он удовлетворяет всем требованиям ВОЗ, предъявляемым в вакцинным клеточным субстратам, и пригоден для производства лечебно-диагностических препаратов. Установлена чувствительность штамма 4921 к заражению энтеровирусами человека, титр вируса полиомиелита штамм Сэбина 1 типа 7,49LG,П типа 7,55LG,Ш типа-7,66LG, титры вируса Коксаки А колебалис 6 от 7,7 до 8,7 LG Тцд 050/мл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

as ®U пи . (У1) С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРС ATOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4374126/30-13 (22) -24.12.87 (46) 07.08.90. Бюл. и 29 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов AMH СССР (72) Л.Л.Миронова, Н.Е.Гольдрин, С.И.Кудинова, В.И.Стобецкий, Т.М.Орлова, В.И.Чернышев, В.Д.Попова, В.Я.Кармышева, Г.А.Алпатова и Г.П.Баранова (53) 578 .085.23 (088 .8) (56) Авторское свидетельство СССР и 764390, кл. С 12 N 5/00, 1980. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

КОЖИ И МЫШЦ ЭМБРИОНА АФРИКАНСКОЙ

ЗЕЛЕНОЙ МАРТЫШКИ ДЛЯ РАЗМНОЖЕНИЯ

ВИРУСОВ (57) Изобретение относится к вирусологии и касается получения нового штамма гетероплоидных клеток из .кожи и мышц эмбриона зеленой мартышкй

4921, изучение его свойств, аттестации в качестве безопасного клеточного субстрата и оценки пригодности для применения в вирусологической практике, в том числе и вакцинном производстве. Цель изобретения - установление нового отечественного штамма перевиваемых клеток кожи и мышц эмбриона африканской

Изобретение относится к области вирусологии, биотехнологии, и касается получения нового клеточного штамма из кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 4921, изучения его свойств, аттестации в качестве безо2 зеленой мартышки с неограниченным количеством субкультивирований. Штамм, 4921 становлен из штамма диплоидных клеток 4921D. В качестве среды роста применена среда, Игла МЕМ с 103 сыворотки крупного рогатого скота. Штамм

4921 гетероплоидный, обладает устойчивыми биологическими и морфологическими свойствами, видовая принадлежность подтверждена кариологическим анализом. Создан банк посевных клеток на уровне 42 пассажа..Он состоит из 286 ампул, содержащих 6 " х 10 клеток в каждой, отконтролирован на безопасность. Кроме того, имеется 6 млрд. клеток на различных уровнях пассажей, заложенных в круп- З ногабаритные контейнеры. Штамм свободен от посторонних агентов - микробов, грибов, вирусов, микоплазм, не онкогенен. Он удовлетворяет всем требованиям ВОЗ, предъявляемым к вак- ф цинным клеточным субстратам и пригоден для производства лечебно-диагно-. стических препаратов. Установлена чувствительность штамма 4921 к заражению энтеровирусами человека, титр вируса полиомиелита штамма Сэбина Х

,òèïà 7,49 lg, Ii типа 7,55 lg, III, типа - 7,66 lg, титры вируса Коксаки 4: .А колебались от 7,7 до 8,7 Ig ТЦД /мл. пасного клеточного субстрата и оценки пригодности для применения в вирусологической практике, в том числе и в вакцинном производстве.

Цель изобретения - установление нового отечественного штамма переви1583440

Ваемых клеток кожи и мышц эмбриона африканской зеленой мартышки с неограниченным количеством субкультивирований - удобной и доступной лабораторной модели, пригоднои как

5 для вакцинного производства, так и для научно-исследовательской работы, Проведена криоконсервация штамма

М4921 на различных уровнях пассажей:

1 жидком азоте хранится более 6 млрд„ клеток. Штамм 4921 хранится во Все: оюзной специализированной коллекции еточных культур Института медици.,: кой генетики АИН СССР на уровне 42 ассажа (10 пассаж после трансфор: а . ии), ему присвоен регистрационный омер 11-Э(15/3/9). Из эмбриона афиканской зелено" мартышки, зарегист, ированной в виварии под 11 4921, полуиено два вида культур — штамм диплочдых клеток, обозначенный 4921D и тамм гетероплоидных клеток — 4921.

Проведена криоконсервация штамма

«и9210 на ранних уровнях пассажей: в жидком азоте находится более 4 млрд, клеток. Штамм 4921D хранится во Всесоюзной Специализированной коллекции кпеточных культур Института медицин- кой генетики АИН СССР на уровне 9 пассажа, ему присвоен регистрационный номер l2-D(15/3/9).

Ш тамм 4921 получают следующим образом. Первичную культуру готовят из мбриона-африканской зеленой мартышки З5

cercophithecus aethiops), выделенного путем кесарева сечения в клинике обезьян ИПВЗ АИН СССР. Обезьяна

4921 йрошла 45-дневный карантин

40 и была кпинически здорова.

Дискретные клетки получают с помощью метода щадящей тринсинизации "sмельченных кусочков кожи и мышц эмбри = она 0,25й;-ным раствором трипсина при

4э чередующихся контактах с питательнои средой. Клетки ресуспендируют в среде

Игла ИЕИ с 10>, сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) и эксплантируют в два полуторалитровых матраса с концентрацией клеток 12 ° 10и/мл . Сосуды с клетками инкубиррют при 37 С. В первичной культуре монослой формируется на 5-6 сутки. В зависимости от срока формирования монослоя проводится первое субкультивирование, а все последующие - по четкому графику: два раза в неделю, так что интервал между перевивками клеток постоянно составляет 3-4 суток. Используют среду того же состава.

Отделение клеток от стекла осуществляют 0,254-ным раствором трипсина.

Криоконсервируют клетки с использованием 10 глицерина, 15й; СКРС и

/53 среды роста. При восстановлении после замораживания используют среду роста. Жизнеспособность клеток колеблется от 51 до 89

Культуральные свойства. Штамм

49215 характеризируется следующими признаками. Жизненный цикл диплоидного штамма составляет 50+10 пассажей. Фазы роста: становлениь - 1-3 пассаж, активный рост - 3-30 пассаж, старение - 30-50 пассаж. Кратность рассева в первых. двух фазах 1;3, реже 1:2, в третьей - 1:1,5, 1:1.

Посевная доза 100-l20 10з в 1 мл.

Среднее чис.по число популяционных удвоений 50, среднее время удвоения популяции 60 ч. В фазе старения .эти показатели составляют 10 и 73 соответственно. При изучении видовой принадлежности показано, что изоферменты лактатдегидрогеназа и глюкозо6-фосфат дегидрогеназа - энзимограммы обезьян, Иорфологические поизнаки. В первичной культуре монослой состоит из

Фибробластоподобных клеток с примесью эпителиоподобных клеток. По мере культивирования количество последних уменьшается, но полностью они никогда не исчезают. В Фазе активного роста преобладают фибробластоподобные клетки, в некоторых пассажах культура кажется мономорфной.

Кариологическая характеристика.

Кариологический анализ проводят на уровне 12, 1Î9, 28, 57 пассажей по

1000 метафаз. Кариотип 2п = 60, ХХ.

Число клеток с отклонениями в наборе хромосом колеблется в пределах 12-203 и в число диплоидных клеток входят метафазы с пробелами и разрывами, но с числом хромосом 60.

Контроль штамма 4921D на посторонние контаминанты. На уровнях l0 14, 24 и 37 пассажей клетки штамма 492Ю и собранную с них культуральную жид- кость испытывают на безопасность. В опытах на животных и чувствительных клеточных системах, а также методом электронной микроскопии посторонних агентов не обнаружено. Тесты на онкогенность на уровне 10, 20, 31, 43 логических методов на уровнях 51, 59 и 102 пассажей. Для характеристики динамики формирования монослоя окрашенные гематоксилином и эозином препараты Фиксируют на 1, 2 и 3 сутки после посадки клеток.

Характер роста, Форма клеток и ядер отличаются от морфологии диплоидных клеток штамма 4921D; представленных B основном веретеновидными фибробластоподобными клетками с удлиненными ядрами.

На первые сутки роста в культуре

51 пассажа наряду с фибробластоподоб1 ными клетками присутствуют в эначительном количестве эпителиоидные клетки с округлыми ядрами и пластин- . чатой цитоплаэмой. На 2-3 сутки 51, а также 59 и 102 пассажей эпителиоподобные клетки преобладают. Наблюдается их значительный полиморфизм.

Культура состоит иэ эпителиоидных полигональных клеток. отличающихся по форме и величине. Полиморфизм увеличивается с пассажами,. что характерно для трансформированных культур.

Цитоплазма эпителиоидных клеток всех уровней пассажей имеет пластинчатый характер, ядра округлые преимущественно с 1-2 ядрышками. На разных участках препаратов встречаются клетки с увеличенными ядрами, а также клетки с 2-3 и большим числом ядер (1-54). Среди митоэов имеются аномальные деления (многополюсные), с неправильным расположением и расхождением хромосом, местами неравномер- . ным делением ядер. Внутриядерных и цитоплазматических включений, вакуолизации и других признаков контаминации клеток не обнаружено.

Кариологическая характеристика.

При кариологическом изучении штамма

4 4921 на уровне 43 и 56 пассажей уста" новлено, что штамм - гетероплоидный.

Число хромосом колеблется от 57 до

63. Иодальный класс — с 61 хромосомой.

Контроль штамма 4921 на посторонние контаминанты. При обследовании клеток штамма 4921 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) были получены отрицательные результаты на уровнях 34-112 пассажей.

При исследовании культуральных жидкостей и самих клеток на уровнях

39, 51, 72, 104 пассажей в чувствительных клеточных системах - в пер5 1583440 6 пассажей, проведенные на линейных мышах СВА, отрицательны.

Клетки штамма 49210 чувствительны к заражению вакцинными штаммами Сэбина вируса полиомиелита, титры которых составили 7,21 1g БОЕ/мл для

I типа; 6,50 - для II типа и .7,64 для III типа. После длительного хранения в жидком азоте клеток штамма

492Ю на уровне 32 пассажа получен штамм гетероплоидных клеток 4921 с высокой пролиферативной активностью.

Штамм 4921 характеризируется следующими свойствами.

Культуральные свойства. После восстановления клеток штамма 4921D на уровне 32 пассажа монослой сформируется за 5 суток. После перевивки с кратностью рассева 1:2 монослой об- 20 разуется уже за 1 сутки. Отмечено, что на уровне 34 пассажа монослой состоит из мелких фибробластоподобных клеток, которые не встречаются в культуре 4921D. В процессе станов- 25 ления штамма 4921 регистрируют увеличение .числа эпителиоподобных клеток, но, начиная.с 39 пассажа, в культуре преобладают фибробластоподобные клетки. При кратности рассева 1:3 монослой формируется за сутки, а после его уплотнения на 3 сутки в

1,5 л матрасной колбе на уровне 38 и 39 пассажей содержится 97 и 90 х 10 клеток соответственно.

В одной серии опытов проводят 112 последовательных пассажей. При этом культура в основном состоит из Фибробластоподобных клеток, но при изменении условий культивирования - смена серий сывороток и среды вызывает изменение. внешнего вида культуры. Например, на уровне 59,84 и 90 пасса жей количество эпителиоподобных клеток в монослое значительно увеличивается. На 113 пассаже культура помещена в жидкий азот при сохранении высокой пролиферативной активности клеток. Последняя в 2-3 раза выше, чем у клеток штамма 492%.

Для перевивок применяют среду

Игла ИЕИ с 103 СКРС.. В качестве крио" протектора используют 103 глицерина, клетки ресуспендируют в среде Игла ИЕИ, содержащей 103 СКРС, с концентрацией

4 «10 /мп. Жизнеспособность клеток

6 составляет 82+53.

Иорфологические признаки. Штамм

4921 изучают с использованием цито10

7 15 вичной культуре клеток почек .африканских зеленых мартышек, в двух штаммах диплоидных клеток эмбриона человека и первичной культуре клеток почек кролика, а также в реакции гемадсорбции с эритроцитами морской свинки вирусы-контаминанты не выявлены.

При обследовании клеток штамма

4921 на тех же уровнях пассажей в опытах на новорожденных и взрослых белых мышах, кроликах, морских свинках, на куриных эмбрионах и иммунодепрессированных мышах линии СВА посторонних агентов, в том числе онкогенных, не обнаружено.

Чувствительность к вирусам. Опре делена чувствительность штамма 4921 к заражению энтеровирусами человека.

К первичному заражению без адаптации культура чувствительна к вакцинному штамму Сэбина трех типов вируса полиомиелита, Коксака А-7, 9, 14, 16.

Пример 1. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм

Сэбина тип I.

В матрасную колбу вместимостью

1,5 л с монослоем клеток штамма 4921 на уровне 39 пассажа вносят подогретую до 37 С смесь 0,253-ного раствора трипсина и 0,023-ного раствора версена в равных объемах (общее количество 20 мл). Ионослой ополаскивают несколько раз, жидкость удаляют, а культуру помещают в термостат при

37 С на 2-3 мин. Затеи колбу встряхивают до полного отделения клеток и вносят 500 мл среды роста, клеточную взвесь энергично встряхивают и разливают в 20 флаконов вместимостью

100 мл по 25 мл в каждый. В качестве среды роста используют среду Игла ИЕМ с 104 СКРС. Культуру инкубируют при

37 С в течение 3 суток до момента

Формирования монослоя.

При заражении питательную среду удаляют, клеточный слой однократно промывают рабочим раствором Эрла и вирус полиомиелита вносят в разведении 10 »5 мл среды ГЛАЭИ (0,54 гидролизата лактальбумина на растворе Эрла с равным количеством среды.

Игла). Инфицированные культуры инкубируют при 34 С. Учет результатов проводят, начиная с 2 суток после заражения. Титр вируса полиомиелита штамм Сабина Х типа был равен =

7,49 1g 60E/мл.

ЗО

5G

Пример 2. Способ культивиро вания вируса полиомиелита штамм Сэбина II типа.

Культуру клеток штамма 4921 на уровне 40 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере I, при этом титр вируса составил 7,55 1g БОЕ/мл.

П р и и е р 3. Способ культивирования вируса полиомиелита штамм Сэбина III типа.

Культуру клеток штамма 4921 на уровне 40 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1, при этом титр вируса составил 7,66 1g БОЕ/мл.

Пример 4. Способ культивирования вируса Коксаки А-7.

В матрасную колбу вместимостью

1,5 л с монослоем клеток штамма 4921 на уровне 55 пассажа вносят подогретый до 37 С 0,254""ный раствор трипсина в объеме 20 мл. Ионослой ополас,кивают несколько раз, жидкость удаляют, а колбу помещают на аналогичный сосуд, заполненный подогретой до 38 С водой. Через 2-3 мин колбу энергично встряхивают до полного отделения клеток от стекла и вносят

400 мл среды роста. Клеточную взвесь энергично встряхивают и оазливают на 200 пробирок по 2 мл в каждую.

В качестве среды роста используют, среду Игла ИЕИ с 104 СКРС. Культуру инкубируют при 37 С в течение 2 суток до момента формирования монослоя.

При заражении питательную среду удаляют, клеточный слой однократно промывают рабочим раствором Эрла, и вирус вносят в соответствующем разведении на растворе Эрла по 0,2 мл, Время адсорбции 40 мин при комнатной температуре. Затеи вносят 1,8 мл среды ГЛАЗИ. Инфицированную культуру инкубируют при 37 С. Учет результата проводят, начиная с 3 суток после заражения. Титр вируса Коксаки A-7 равен 8;,70 1 ТЦД,/мл.

Пример 5. Способ культивирования вируса Коксаки А-9.

Культуру клеток штамма 4921 на уровне 55 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 4, при этом титр вируса составляет 8,70 1g ТЦД,/мл.

П р и и е р 6. Способ культивирования вируса Коксаки A-14..1583440

Культуру клеток штамма 4921 на уровне 55 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 4, при этом титр вируса составляет 8,36 1g ТЦД /мл.

Пример 7. Способ культивирования вируса Коксаки А-!б.

Культуру клеток штамма 4921 на уровне 55 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 4, при этом титр вируса составляет 7,70 ig ТЦД,/мл.

Таким обоазом, предлагаемая клеточная система 4921 представляет но. вый отечественный штамм гетероплоид. ных перевиваемых клеток кожи и мышц эмбриона аФриканской зеленой мартышки.

Формула и зобретения

Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона аФриканской зеленой мартышки ВСКК-D М 11D (15/3/9) для размножения вирусов.

Составитель И.Тареева

Редактор Н.Яцола Техред Л.Олийнык Корректор Т.Палий

Заказ 2231 Тираж 493 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по -изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óèãoðoä, ул.Гагарина, 101