Способ определения удельной скорости роста дрожжевой популяции

 

Изобретение касается микробиологической промышленности и может быть использовано в системах автоматизированного контроля и управления процессом культивирования микроорганизмов при производстве белково-витаминных концентратов. Цель изобретения - повышение точности определения удельной скорости роста микробной популяции и увеличения временного упреждения в ее определении. Сущность способа заключается в том, что группу живых клеток разбивают на активные, дающие прирост биомассы, и ослабленные, практически не дающие прироста биомассы клетки, определяют относительное содержание активных клеток в популяции, идентифицируют коэффициент пропорциональности из условия минимума суммы квадратов разностей экспериментальных и расчетных данных о количестве активных , ослабленных и мертвых клеток на заданном отрезке времени, затем умножают коэффициент пропорциональности на относительное содержание активных клеток. 2 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (51)5 С 12 Q 3/00!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbfTHRM

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4375705/30-13 (гг) 08.01.88 (46) 07.08.90. Бюл. и 29 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеэа белковых веществ и Институт микробиологии АН СССР (72) К.А.Яновский, В.И.Шихер, И.Н.Позмогова, А.Ю.Винаров, Н.Д.Берестенникова, В.А.Маркелов, А.Ю.Варьяш,.

Б.П.Пантелеев, Е.Г.Назеева, В.И.Грищенко, А.Л.Локотко, А.Р,Степневский, В.В.Кузин и H.È.Ëîãèíîâà (53) 663.14 (088.8) (56) Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев Л.С. Моделирование биохимических реакторов. - М.: Лесная промышленность, 1979.

Печуркин Н.С. Динамика возвращения непрерывной культуры в активное coc" тояние после снятия неблагоприятного воздейатвия. Инженерные проблемы микробиологического синтеза. - M., ВИИИА, 969, с.249-251. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УДЕЛЬНОЙ

cK0p0cTN р0сТА дРОжжеВОЙ пОпуляции (57) Изобретение касается микробиоИзобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при культивировании дрожжей.

Цель изобретения - повышение точности определения удельной скорости роста микробной популяции .и увеличенйе временного упреждения в ее определении.

На фиг. 1 показано сравнение экспериментальных и. расчетных данных по

2 логической промышленности и может быть использовано в системах автоматк:-.ированного контроля и управления процессом культивирования микроорганизмов при производстве белкововитаминных концентратов. Цель изобретения - повышение точности определения скорости роста микробной популяции и увеличение временного упреждения в ее определении. Сущность способа заключается в том, что группу живых клеток разбивают на активные, дающие прирост биомассы, и ослабленные, практически не дающие при-1;.: роста биомассы клетки, определяют относительное содержание активных клеток в популяции, идентифицируют коэффициент пропорциональности из условия минимума суммы квадратов разностей экспериментальных и расчетных данных о количестве активных, ослабленных и мертвых клеток на заданном Д отрезке времени, затем умножают коэффициент пропорциональности на относительное содержание активных клеток. 2 ил. О биомассе (х) и удельной скорости роста {p) в процессе непрерывного культивирования Candida maltosa ВСБ-569 на среде с парафином сначала при 9 =

= 0,16 ч -, затем при смене Р на

0 08 ч, где 1,4 - х; 2 5 - х

3,6 - р (кривые 1-3 - экспериментальные данные; кривые 4-6 - расчетные данные); на фиг. 2 - сравнение экспериментальных и расчетных данных по х и и в процессе непрерывного

1583443 вращаются в группу активных х . ОбоOf значим эту с.корость (. Также вероятна гибель другой части клеток груп5 пы ослабленных х со скоростью ofp ..

Составляют систему балансных уравнений по каждой из трех групп клеток при непрерывном культивировании:

Йх, ----.= х - о(х ,1 о х -Пх

dx„

----- = (х - Dx ,1 Э и. (3) Известно, что

dx — рх - Dx.

dt (5) (5) х

Р=1 х„+ х + х (6) (1) 4О х = х + х,+ х

Активные, ослабленные и мертвые клетки идентифицируют по значениям оптической плотности цитоплазмы, которые для активных клеток заключены в пределах 5,5-6,5, ослабленных 4,05,4, мертвых - ниже 4,0 и более 7,0.

Соответственно скорость роста

50

dx dxof dxo

+ йе с1с : йс

+ ---- (2)

dx„.

dt культивирования Candida maltosa

BCB-569 на среде с парафином сначала-при D = 0,15 ч-, затем при смене

9 на 0,25 ч, где показано стрелкой

1,4 - х ; 2 5 - х; 3 6 - р (кривые

1-3 - экспериментальные данные; кривые 4-6 - расчетные данные).

Способ заключается в том, что группу живых клеток разбивают на активные, дающие прирост биомассы., и слабленные, практически не дающие рироста биомассы, клетки, определят относительное содержание активнь1х леток в популяции, идентифицируют оэффициент пропорциональности из словия минимума суммы квадратов разостей экспериментальных и расчетных анных о количестве активных, ослабенных и мертвых клеток на заданном трезке времени, умножают коэффицинт пропорциональности на относитель = ое содержание активных клеток, .полуая тем самым искомый параметр.

На сканирующем микроскопе, соедиенном с 3ВМ, анализируют через равые промежутки времени многослойные репараты пробы, взятой из Ферментера, Й выдают следующие морфологофизиологи чес кие па ра метры поп уля ции: распределе лие клеток по размерам, форме, содержание липидных включений и вакуолей,„ степени гетерогенности протоплазмы (моменты распределения ее оптической

1 лотности), а также процентное содержание мертвых и почкующихся клеток.

Всю биомассу представляют в виде суммы клеток (х) активных (x„); ослабленных (x ) и мертвых (х ):

Клетки группы х образуют биомасс со скоростью р за счет роста (увеличения объема) и почкования. Часть клеток этой группы переходит в груп- 1 пу ослабленных х „ со скоростью

В свою очередь клетки группы х возdxof

- -- = рх,„- g х,„+ Й х,. — Dx„;

Подставляют (3) в (2), получают

dx

px - (Dx„+Dx +Dx ) px, - D(x + х, + х ). (4) Сравнивают уравнения (4) и (5}, получают расчетную Формулу для удельной скорости роста микроорганизмов: или с учетом уравнения (1) окончательно получают

В процессе промышленного культивирования микроорганизмов через определенные интервалы времени (например, через 2 ч) определяют количество активных хе,, ослаоленных х „ и мертвых клеток х . Используя эти экспериментальные данные, по значениям х, x,, x определяют коэффициенты p, of,of, е/> из системы балансных уравнений (3) подбором таких значений указанных коэффициентов, которые обеспечили бы в заданном интервале времени максимальное, сближение расчетных и экспериментальных значений х, х „ х„, т.е. из условия минимума суммы квадратов разностей экспериментальных и расчетных значений активных, ослабленных и мертвых клеток на заданном отрезке времени.

Затем умножают коэффициент пропорцихо р = ---- = 0,077.

5 15 ональности р на относительное содержание активных клеток {---) и полух х чают искомый параметр - значение удельной скорости роста ч.

П р и и е р 1. В начале эксперимента, когда популяция дрожжей Candida maltosa ВСБ-569 находится в ста/ ционарном состоянии при D = 0,16 ч, концентрация биомассы составляет

16,5 г/л, из которых 9,5 г/л приходится на активные, 7 г/л - на ослабленные клетки, мертвых клеток не обнаружено. On, еделение содержания (в 4) х„, x, x в популяции проводят в результате сопоставления данных по морфологии, скорости роста клеток и их оптической плотности при использовании сканирующего комплекса микроскопа - ЭВИ "Протва". К активным кле-. кам относят клетки с условной оптической плотностью 5,5-6,5. Обозначена эта активная группа клеток как х

Иертвые клетки характеризуются низкйми значениями (ниже 4) и высокими (более 7) значениями оптической плотности. Эти клетки не изменяют своего объема. Эта группа клеток обозначена х . Остальная часть популяции отнесена к ослабленной группе xä. Она харак теризуется значением оптической плотности 5,4-4,0. После резкого уменьшения скорости разбавления до 0,08 ч " происходит быстрое снижение количества активных кпеток почти до нуля (до

0,5 г/л через 4 ч после смены протока), а затем число их вновь увеличивается до 2 г/л и стабилизируется на этом уровне (фиг.1, кривая 2).

Среднеквадратическая ошибка при оп:,ределении активных клеток экспериментальным путем составляет 104. Расчетные данные коэффициентов по активным клеткам составляют: = 0,4; (,=

= 0,43; а(= 0,02. Кривая изменения скорости роста, полученная с помощью уравнения (6), показывает более плавное изменение р (фиг.1, кривая 6), соответствующее более плавному теоретическому изменению количества активных клеток (фиг.l, кривая 5) по сравнению с экспериментальными данными °

Расчетные данные позволяют выявить на 5 ч ранее, чем экспериментальные, стабилизацию величины удельной скорости роста после смены протока (фиг.1 кривые 3 и 6). Следовательно, 83443 б подобранные значения кинетических коэффициентов p; (,; c(к формулам (3) и {б) корректны, а сама формула (5) может быть использована для оцен- ки р в переходном и в установившемся,, :но с определенной лимитацией.

Через 3 ч х „ = 2,5; x = 13, следовательно

Точность К (фиг.1) определяется д как Я=. ----- 100ь так как,Д =

P цьь иве /л, то Е= 3,753.

Известным способом и можно определить через б ч с точностью

Р иъе Му

20 = ------------ = 103. Точность опреРцэе деления р составляет 3,753 через 3 ч, в -o время как при определении р известным способом 103 и только через.

25 бч

Пример 2. Популяция Candida

maltosa ВСБ-569 находится сначала в стационарном состоянии при D

= 0,15 ч-, х =- 14,5 г/л, хе,=

= 9,8 г/л, х, = 4,7 г/л, х практи30 чески нет, После увеличения скорости разбавления до 0,25 ч " происходит быстрое возрастание количества активных клеток до х „ = 13,3 г/л и . более плавное (инерционное изменение

35 общего количества биомассы x, x ь и х определяют как и в предыдущем

М примере. Через 5 ч после смены протока х = 18 г/л, х ц = 15,7 г/л. Ис-: .

t noJl ьзуя полученные экспериментальные

40,данные, рассчитывают кинетические коэффициенты р; с „ а(и изменение во

ape;:åHè теоретических значений х, х„, р по уравнениям (3), (5) и (6) °

Через 4 ч х = 12,5 г/л, х = 23 г/л, 45 p = 0,4. Точность определения р составляет = 4Ф; р ц = 0,23.

Величина р, определенная через

7 ч известным способом, составляет р = 0,21, соответственно точность

50 определения будет ъ 9Ф. В данном примере точность определения р в 2 раза выше, а р определено на 4 ч ранее.

Таким образом, определение удельной скорости роста дрожжевой популяции по предлагаемому способу позволяет определить удельную скорость роста на 3-5 ч ранее и на 5-6Ф точнее, чем

15834"3 с(х "Dx

dx д 3 м м

xg х + х + хм

О 1 Я Я Ф 6 61ч

ON известным способом, что позволяет поВысить выход биомассы на 5Ф, так как

1очность р.определяет и правильность выбора скорости разбавления D, которая в установившемся режиме должна быть равна p . Следовательно, если проток выставлять по ч, определяемой по предлагаемому способу, то устанавливаться он будет с упреждением во времени на 3-5 ч и точнее на 53, чем по традиционно определямому значению p . .Так как продуктивность равна D х (где х - концентра= ция биомассы), то и выход будет на 3 больше, т.е. с 2,6 повысится до

$,73 г/ 6 ч .

Формула изобретения

Способ определения удельной скоРости роста дрожжевой популяции, предусматривающий учет живых и мертвых клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности 25 определения удельной. скорости роста и увеличения временного упреждения в ее определении, при учете живых I клеток измеряют содержание активных клеток х, дающих прирост биомассы, gg цР и содержание ослабленных клеток х;, практически не дающих прироста биомассы, при этом измерение содержания активных, ослабленных и мертвых клеток х проводят через равные промем жутки времени на заданном временном отрезке, после чего по измеренным значениям х, х» х индентифицируют скорость роста активных клеток р, скорость перехода активных клеток в ослабленные о(„ скорость перехода ослабленных клеток в активные o(. и скорость перехода ослабленных клеток в мертвые о(из условия минимума суммы квадратов разностей измеренных и расчетных данных о количестве активных, ослабленных и мертвых клеток, по формулам рх -0(х +a(x - Эх

dxw ас = ot 1 of

0(° вх, х -e.;õ -o(x - Dx дс — "1 о с м о где 9 - скорость разбавления, после чего рассчитывают удельную скорость р роста по формуле

1583443

Xg, а/л

„ЮГиМеещеае)

3 ф

0,12

6 7,щс

Составитель В. Голимбет

Редактор Н.Яцола Техред Л,Олийнык Корректор Л.Патай ь .

Заказ 2231 Тираж 492 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101