Способ определения фибринолитической активности плазмы крови

 

Изобретение относится к области физиологии и биохимии свертывания крови и может быть использовано в патофизиологии и в клинико-лабораторной практике, для определения степени полимеризации и лизиса нестабилизированного фибрина в плазме. Целью изобретения является повышение точности способа за счет определения суммарного фибринолиза, а также возможности одновременного определения степени полимеризации фибрина. Для этого в плазме крови определяют концентрацию фибриногена, после чего плазму смешивают с 0,3-0,4%-ным раствором фибрин-мономера в соотношении 1:1-1:1,5 к смеси добавляют буфер Палитча с PH 7,6-7,7 в соотношении 1:3-1:4 и инкубируют при 37-37,5°С в течение 60-70 мин, после чего отделяют жидкую фазу от сгустка, который затем гидролизуют щелочью при кипячении и фотометрируют с реактивом Фолин-чикалто. О лизисе нестабилизированного фибрина судят по убыванию количества полимеризованного белка в сгустке, включающем концентрацию фибриногена и фибрин-мономера, а по нарастанию его - о степени полимеризации. Способ можно использовать для диагностики предтромботических состояний и оценки эффективности используемых агентов при их лечении.

СаЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (Я)э G Ol 0 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУД АРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ

Il0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4443672/30-14 (22) 20,05.88 (46) 30.09,90, Бюл. У 36 (71) МГУ им. М,В. Ломоносова (72) В,Е. Пасторова, Л.А. Ляпина, Б.А.Кудряшов и Т.E. Табакина (53) 612,015(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 1273804, кл . G 01 N 33/48, 1986. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМЫ КРОВИ (57) Изобретение относится к области физиологии и биохимии свертывания крови и может быть использовано в патофиэиологии и в клинико-лабораторной практике для определения степени полимеризации и,лизиса нестабилизированного фибрина в плазме, Целью изобретения является повышение точности способа эа счет определения суммарного фибринолиза, а также возможности одновременного определения степени

Изобретение относится к биохимии и физиологии свертывания крови, в частности к клинико-лабораторной диагностики при исследовании действия антикоагулянтов и фибринолитиков на процесс фибринолиэа, и может быть использовано в патофизиологии и меДицине при диагностике состояний, связанных;. с патологией системы гемостаза и их лечении.

Целью изобретения является повышение точности способа эа счет определения суммарного фибринолиза, а также

„.Я0„„3596254 А 1

2 полимериэации фибрина. Для этого в плазме крови определяют концентрацию фибриногена, после чего плазму смешивают с 0,3-0,4Х-ным раствором фиб-. рин-мономера в соотношения 1:l-l:1,5, к смеси добавляют буфер Палитча с рН 7,6-. 7,7 в соотношении 1:3-1:4 и инкубируют при 37-37,5 С в течение 6070 мин, после чего отделяют жидкую фазу от сгустка, который затем гидролиэируют щелочью при кипячении и фотометрируют с реактивом Фолин-Чикалто.,О лизисе нестабилизированного фибрина судят по убыванию количества полимеризованного белка в сгустке, включающем концентрацию фибриногена и фибрин-мономера, а по нарастанию его — о степени полимеризации. Способ можно использовать для диагностики предтромботических состояний и оценки эффективности используемых аген.тов при их лечении.

I возможности определения степени полимериэации фибрина.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут испытуемую плазму крови и опрецеляют в ней фотометрически концентрацию фибриногена, после чего плазму смешивают с 0,3-0,4Ж-.ным раствором фибрин-мономера в соотношении

1: 1-1: 1,5, к смеси добавляют буфер

Палитча с рН 7,6"7,7 в соотношении

1:3-1:4, инкубируют 60-70 мин при

37-37,5 С после чего отделяют жидкую

3 1596254

4" фазу от сгустка, который затеи гидролиэуют в 2 мп 0,1 К 0фОН при кипячении и определяют количество полимвризованного белка. 0 степени лизиса нестабилизироваяного фибрина судят по снижению количества пс1лимеризованного белка в сгустке после инкубации пробы по сравнению с исходным количеством белка, включающим концентрацию 10 фибриногена в испытуемой плазме и количество фибрин-мономера, полимеризованного в пробе в отсутствие плазмы.

0 степени полимеризации нестабилизированного фибрина судят по нарастанию 15 количества полимеризованнаго белка по сравнению с исходным.

Изобретение дает возможность определять в разных типах плазм нормальной, плазме от больных, плазме после введения фибринолитически агентов как степень повышения полимериэации нестабилизированного фибрина, так и степень лиэиса, в то время как с помощью прототипа можно определять в разных образцах плазм лишь степень лиэиса нестабилизированного фибрина, а также определять суммарный лиэис нестабилизированного фибрина под действием как ферментативных, так и нефермеятативных агентов.

Пример 1. Берут цитратную плазму здорового животного (крысы ).

В коническую пробирку объемом 10 мп отбирают 0,2 мл плазмы для определения концентрации фибриногена. В химическую пробирку объемом 20 мп вносят

0,1 мл 0,3 -ного раствора фибри -Мономера, добавляют 0,09 мп испытуемой плазмы и 0,8 мл буфера Палитча с рН 7,6. В контрольную пробирку берут 0 1 мп раствора 0,3 "ного фибринмономера и,0,4 мп буфера Палитча. Пробы ставят инкубировать при 37,0 С на

60 мин, после чего в них отделяют 4 жидкую фазу от сгустка, пробирки со сгустком ополаскивают физиологическим раствором хлорида натрия, опрокидывают вверх дном, подсушивают фильтровальяой бумагой. Затем в пробирки добавляют по 2 мп 0,1 N 0аОН и гидролизуют при кипячении. После охлаждения в пробах фотометрически с реакти" вом Фолии-Чикалто опрвделяют количесТВо полимериэованного белка, а. в конической пробирке, содержащей одну плазму, производят определение концентрации фибриногеиа по методу Бидвелл. Получают: А - количество полимеризованяого белка в иссследуемой плазме - 550 мг,;: В - концентрация фибриногеяа в исследуемой плазме—

480 мг ; С - количество полимеризованного фибрая-мономера в пробе без плазмы - 135 мг ., .

Так как количество полимериэованного белка в пробе с плазмой (А) после инкубации меньше, чем исходное количество белка в этой пробе (фибриноген + фибрин-мояомер:или В+С}, то рассчитываем степень лизиса по формуле (В+С) -А

--ГВ+СУ- «-00 или (480+135)-550 100

480+135 615

=10,б . лизиса.

Таким образом в крови здорового животного отмечена слабая степень лизиса.

Пример 2. Берут цитратную плазму больного Х. до лечения (ожог с поражением 15 поверхности тела, шок ), В коническую пробирку отбирают

0,2 мл исследуемой плазмы для определения концентрации фибриногена.. В химическую пробирку берут 0,15 мп 0,4

0,4 -ного раствора фибрин-мономепа, добавляют 0,11 мл исследуемой плазмы и 1,0 мл буфера Палитча с рН 7,7.

В контрольную пробирку берут 0,15 мл

0,4Х íoãî раствора фибрин-мономера и 1,0 мп буфера Палитча. Пробирки инкубируют при 37,5 С в течение

70 мнн. После инкубации в пробирках отделяют жидкую фазу от сгустка, который после промывки физиологическим раствором гидролизуют как и в примере 1.Затем в пробах фотометрически определяют количество полимериэованного белка, а в пробирке, содержащей одну плазму, проводят определение кон" центрации фибрияогена. Получают: Аколичество полимериэованного белка в пробе с плазмой - 1050 MrX,  — концентрация фибриногена в плаэме405 мг .; С вЂ” количество полимеризованного белка в пробе без плаэмы250 мг%.

Так как количество полимеризованного белка в пробе с плазмой 1О (1050 MrX} превышает количество исходного белка (фибриноген+фибрин«мономер или 405+260=655 мг ), то рассчитываем степень полимеризации нестабилизированного фибрина в ис159625

5 следуемой пробе по формУле 100.

В+С

Получают

«100 160Х полимеризации.

405+250

Таким образом в плазме больного отмечается высокая степень полимери зации нестабилизированного фибрина (и, следовательно, отсутствие лизи" са), что свидетельствует о склонности к тромбообразованию.

Пример 3. Берут цитратную плазму больного N до лечения (ожог !5

10 поверхности тела, шок). В коническую пробирку отбирают 0,2 мп плазмы для определения фибриногена. В химическую пробирку берут 0,1 мл определяемой плазмы и добавляют 0,15 мл

О,ЗХ-ного раствора фибрин-мономера и 0,8 мл буфера Палитча с рН 7,65.

В контрольную пробирку берут 0,15 мл

0,35Х-ного раствора фибрин-мономера и 0,5 мл буфера Палитча, Пробы инкуби-25 руют при 37,5 С 65 мин, после чего в них отделяют жидкую фазу от сгустка и далее поступают как в примерах 1 и 2, После фотометрирования получают:

А — количество полимеризованного бел- 30 ка в пробе с плазмой — 1060 мг .;

В - концентрация фибриногена в испытуемой плазме — 605 мг .; С вЂ” количество полимериэованного белка в пробе беэ плазмы — 160 мгХ, 35

Так как количество полимеризованного белка в испытуемой пробе (А) превышает исходное количество белка (фибриноген + фибрин — мономер), то рассчитывают процент полимеризации 4( нестабилизированного фибрина в пробе по формуле, как и в примере 2:

А 1060

В+С х 100 или s 1001 38, 5Х по-, 605+160 лимериэации. 45

Таким образом в плазме больного отмечается высокая степень полимеризации нестабилиэированного фибрина, Следовательно, в плазме больного име- 50 ется тенденция к тромбообразованию, Пример 4. Берут цитратную плазму того же больного N. после проведения противотромботической терапии: однократно гепарин в дозе .

10000 ИЕ и затем на фоне гепариниэа" ции по 2500 ИЕ шестикратно в течение суток. Все обьемы реагентов и операции такие же, как и в примере 3.

4 6

После фотометрирования получают:

А — количество полимериэованного белка в пробе с.плазмой - 580 мгХ1,  — концентрация фибриногена в испытуемой плазме - 720 мгХ; С " количество полимеризованиого белка впробе беэ плазмы - 160 мгХ.

Так как количество полимеризованного белка в испытуемой пробе ниже, чем исходное количество белка, подвергающееся полимеризации (фибрииоген + фибрин-мономер ), то рассчитывают степень лизиса нестабилиэированного фибрина по формуле, как в примере 1:

+С) A 1oo (В+С) получая (720+160)-580

«100 34% лиэиса, (720+160)

Таким образом гепариниэация больного оказывает положительное влияние на гемостаэ — вызывает лизис нестабилизированного фибрина и, следовательно, снижает степень риска тромбообразования.

Использование испытуемой плазмы без смешивания с f-аминокапроновой кислотой позволяет определять суммарный лизис при действии как ферментативных, так и неферментативных фибринолитиков и других агентов, т.е. расширяет спектр применяемых лизирующих агентов, В прототипе определяют степень лизиса за счет лишь фибринолитников неферментативной природы; кроме степени лизиса предлагаемый метод позволяет определить степень полимеризации нестабилизированного фибрина1 метод позволяет диагностировать в плазме больных повышенную степень тромбоопасности по увеличению полимеризации нестабилизированного фибрина; метод позволяет судить о6 адекватности дозировок применяемых терапевтических агентов с целью снижения риска тромбообразования.

Формула изобретения

Способ определения фибринолитической активности плазмы крови путем получения полимеризованного фибринмономера, обработки его исследуемой плазмой, инкубации с последующей фотометрической регистрацией количества полимеризованного белка в смеси, и расчетом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности

1596254

Составитель А. Агуреев

Редактор Не Герват Техред И.Дидык Корректор С. 01евкун

° Ю» ° Ф» »»»

Заказ 290б Тираж 511 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Произв ственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 г способа. эа счет определения суммарно" го фибринолиза, а.также возможности одновременного определения степени пояимериз ации фибрина 9 предварительно

) в. плазме определяют концентрацию фиб5 риногеиа, а полимеризованный фибрин» мономер получают путем одновременного смешивания фибрин-мономера, буфера

Палитча и плазмы, при этом в первона.чально полученную смесь, содержащую

0,09-0,11 мл плазмы и 0,09-0,135 мп

0,3-0,4Æ-ного раствора фибрин-мономера, добавляют буфер Палитча в объем- ном соотношении 1:3-1:4.