Штамм бактерий escherichia coli-продуцент фрагмента кленова

 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано при проведении работ по получению и определению структуры рекомбинантных молекул ДНК. Целью изобретения является повышение выхода фрагмента Кленова (большого фрагмента ДНК-полимеразы I) в расчете на 1 г биомассы. Новый штамм Е. coli ВКПМ В-3825 получен путем трансформации штамма Е. coli Y 1089 рекомбинантной плазмидной ДНК рСЕК 10 и последующей селекцией рекомбинатных клонов по содержанию белка (не менее 30% от общего количества) с активностью фрагмента Кленова. Штамм Е. coli ВКПМ В-3825 - продуцент фрагмента Кленова обеспечивает синтез большого фрагмента ДНК - полимеразы I в количестве примерно 1×10⁶ ед.акт./1 г сырой массы клеток. При соблюдении оптимальных условий выделения и очистки выход чистого фрагмента Кленова составляет 980-995 тыс.ед. акт/1 г сырой биомассы, что примерно вдвое выше, чем для известного рекомбинатного штамма Е. coli, содержащего ту же плазмиду, и в 20 раз больше, чем для самого продуктивного из все известных продуцентов данного фермента.

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может быть широко использовано при получении рекомбинантных молекул ДНК и определении первичной структуры полидезоксинуклеотидов. Целью изобретения является повышение выхода фрагмента Кленова (большого фрагмента ДНК-полимеразы I) в расчете на 1 г биомассы. Новый штамм Escherichia coli - продуцент фрагмента Кленова получен путем трансформации штамма Y 1089 рекомбинантной плазмидной ДHК рСЕК 10 и последующей селекцией рекомбинантных клонов по содержанию белка (не менее 30% ) с соответствующей ферментативной активностью. Рекомбинантная плазмида рСЕК 10 получена путем клонирования фрагмента ДНК E. coli, кодирующего ген ДНК-полимеразы I, в плазмиде рсЕZ 12. Полученный рекомбинантный штамм E. coli обеспечивает выход фрагмента Кленова около 1000000 ед.акт./г биомассы. Штамм - продуцент фрагмента Кленова - депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика под номером В-3825. Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы, 1,2-1,6х2,0х6,0 мкм подвижные, с перитрихальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Культуральные признаки. Хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном агаре колонии гладкие, круглые, прижаты, блестящие, серые, край ровный, мутные. При росте в жидких средах, мясопептонном бульоне, L-бульоне образуют ровную интенсивную муть. Физиолого-биохимические признаки. Растут в пределах 10-40^оС при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности глюкозу, фруктозу, арабинозу, лактозу, галактозу. В качестве источника азота используют минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, в органической форме - пептон, аминокислоты; нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Уреазная активность не обнаруживается, Индол не образуют. Устойчивость к антибиотикам: проявляют устойчивость к тетрациклину и ампициллину. П р и м е р 1. Получение штамма - продуцента фрагмента Кленова. Для получения штамма - продуцента фрагмента Кленова штамм E.coli Y 1089 трансформируют ДНК плазмиды рСЕК 10. Трансформанты высевают на чашки с селективной средой, содержащей тетрациклин (20 мкг/мл) и ампициллин (50 мкг/мл), выращивают при 30^оС 14 ч. Четыре случайно выбранных клона высевают в 3 мл среды LB с 20 мкг/мл тетрациклина и выращивают до оптической плотности 1,0 при длине волны 540 нм ( ≈ 10⁶ кл./мл). Затем температуру повышают до 42^оС и выращивание продолжают при интенсивной аэрации еще 4 ч. Из каждой культуры отбирают аликвоты объемом 0,5 мл. Клетки в отобранных аликвотах собирают центрифугированием (1200 g) в течение 5 мин, промывают буфером, содержащим 50 м М трис-HCl, рН 7,5, замораживают жидким азотом и тестируют в них содержание фрагмента Кленова. Тестирование клонов на содержание фрагмента Кленова проводят методом белкового гель-электрофореза по Лэмли. Для этого замороженные клетки суспендируют в 0,05 мл раствора, содержащего 1%-ный додецилсульфат натрия, 1%-ный β-меркаптоэтанол, 5 М мочевину, 0,05 М трис-HCl, рН 6,8, 0,01%-ный бромфеноловый синий и прогревают в водяной бане при 100^оС в течение 10 мин. Пробы объемом 4 мк анализируют гель-электрофорезом в полиакриламидном геле. Клоны, содержащие по результатам сканирования геля не менее 30% белка с электрофоретической подвижностью, соответствующей фрагменту Кленова, выращивают в 1 мл среды и определяют в них ферментативную активность. В штамме E.coli В-3825 содержится около 1,0х10⁶ ед. акт. фрагмента Кленова на 1 г сырой биомассы. Выход биомассы составляет 5-7 г на 1 л среды. П р и м е р 2. Выделение и очистка фрагмента Кленова. 5 г клеток E.coli ВКПМ, В-3825 суспендируют в 30 мл 50 мМ трис-HCl буфера, рН 8,0, содержащего 2 мМ ЭДТА 0,01 мМ дитиотреитола, 233 мМ NaCl, 0,13 мг/мл лизоцима. Полученную суспензию обрабатывают на ультразвуковом дезинтеграторе при частоте 20 кГц и амплитуде 18 мкм. Для удаления клеточного дебриса и получения грубого экстракта суспензию центрифугируют при 18000 об/мин в течение 30 мин. К грубому экстракту добавляют 10%-ный полиэтиленимин до конечной концентрации его в экстракте 0,5%. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. Супернатант подвергают фракционированию сульфатом аммония и последовательному хроматографированию на фосфоцеллюлозе Ф-11 и голубой декстран-сефарозе. Выход фрагмента Кленова 980000 ед.акт/г биомассы. П р и м е р 3. Зависимость выхода целевого продукта от концентрации полиэтиленимина. Выделение и очистку фермента проводят, как описано в примере 2, за исключением того, что на стадии осаждения нуклеиновых кислот полиэтиленимином 10% -ный раствор последнего добавляют до конечной концентрации 0,6% и 0,7%. Выход фрагмента Кленова при использовании концентрации полиэтиленимина 0,6% 995000 ед. акт. /1 г биомассы; при использовании концентрации 0,7% 990000 ед.акт./1 г биомассы. Таким образом, новый штамм E.coli ВПКМ В-3825 - продуцент фрагмента Кленова обеспечивает синтез большого фрагмента ДНК-полимеразы I в количестве примерно 1х10⁶ ед.акт/1 г сырой массы клеток. При соблюдении оптимальных условий выделения и очистки фермента выход очищенного фрагмента Кленова составляет 980-995 тыс.ед. акт/1 сырой биомассы, что примерно в 2 раза выше, чем для известного рекомбинатного штамма E.coli, содержащего ту же плазмиду, и в 20 раз больше, чем для самого продуктивного из всех других известных продуцентов данного фермента. Предлагаемый штамм позволит улучшить обеспечение генно-инженерных работ фрагментом Кленова - ферментом, необходимым для осуществления таких важнейших процедур, как получение и определение структуры молекул рекомбинантных ДНК.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3825 - продуцент фрагмента Кленова.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 18.11.2000

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2003

Извещение опубликовано: 10.04.2003        

---