Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l, используемый для получения моноклональных антител к человеческому коллагену i и iii типа

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в медицине и биологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L, продуцирующего моноклональные антитела (МОН АТ) к человеческому коллагену I и III типа. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной человеческим коллагеном I типа, с клетками миеломы мыши Х63 Р3/Ад 8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N163 Д. Гибридому культивируют в среде ДМЕМ с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сывороткой, 2 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгизона, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола при 37°С в атмосфере 5% CO<SB POS="POST">2</SB>. Штамм продуцирует МОН АТ класса YGM, которые специфически связываются с человеческими коллагенами I и III типов. На 3-4 день культивирования концентрация МОН АТ составляет 1-10 мкг/мл в культуральной среде и 10-30 мг/мл в асцитной жидкости.

СО!ОЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С !2 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЭОБРЕТЕНИЯ И ОТН 11ТИЯЦ

ПРИ ГЙНТ СССР (21) 4620831/30-13 (22) 15. 12. 88 (46) 30. 10.90. Вюл. Р 40. (71) Всесоюзный кардиологический научный. центр .АИН СССР (72) А. В. Рудин, И. Н ° Трахт, Г. Л. Идельсон и С. П. Домогатский (53) 578.085.23(088,8) (56) Macarak F. J., Howard Р. S., La1ly Е. Т. — J. Hist СУТ, 1986, V. 34, 8, 1003-1011. (54) ИТТИ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕ121Х

KJIET0K ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L. ИСПОЛЬЗУЕ1ИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСК01Ю КОЛЛАГЕНУ I И III ТИПА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в медицине и биологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в медицине и биологии.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus mussulus Ь, продуцирующего моноклональные антитела к человеческим коллагенам I u III типов.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/Ñ иммунизируют подкожно введенивм 50 мкг человеческого коллагена I типа в 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда. Через 10 и

„„SU „„1602867 А 1

2 ток животных Mus musculus L., продуцирующего моноклональные антитела (МОН АТ) к человеческому коллагену I и III типа. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мыши линии

BALB/Ñ, иммунизированной человеческим коллагеном I типа, с клетками миепомы мыши Х63 P8/Ag 8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Р 163Д. Гиб ридому культивируют в среде ИПЖ с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сыворотки, ? м11 1.-глутамина, 2 MN пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл Аунгизона, 0,05 м1: ь, 2-меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% ГО2. Штамм продуцирует КОН AT класса Х8М, которые специфически связываются с человеческими коллагенами

I u III типов. На 3-4 день культивирования концентрация ИОН AT составля- С ет 1-10 мкг/мл в культуральной среде и 10-30 мг/мл в асцитной жидкости.

20 дней. после первого введения прово- Q0 .дят дополнительные иммунизации анало- ф гичным образом. Через 3 дня после последней иммунизации иммунных мышей забивают, 15х10 клеток селезенки.

7 гибридизуют с 5х10 клеток миеломы

7, мыши Х63.РЗ/Ag 8; 653 в течение 1 мин в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45% (по объему) полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы 1000 и 15% диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки клеток средой DNEM от ПЭГ клетки высевают в 96-луночные панели

1602867 по 1х10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду DMEM с добавлением 20% эм» бриональной коровьей сыворотки, 2 мИ

L-глутамина, 10 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгизона, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,15% гидрокарбоната натрия, 100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкИ аминоптерина, 16 мМ тимидина в атмосфере 5% углекис о лого газа при 37 С.

С помощью иммуноферментного метода отбирают гибриды по способности продуцировать антитела к коллагенам I u

III типов. Отобранные гибриды дважды клонируют методом конечных разведений. После повторного клонирования практически 100% субклонов продуциру . ют антитела к коллагенам. Продукция этих антител сохраняется, по крайней мере, до 50 пассажа.

Условное наименование нового штам- . ма НС1.

Условное наименование антител, син- 5 тезируемых штаммом НС1, АмС1» штамм депонирован в специализиро ванной коллекции перевиваемых соматических.клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) N - 163Д и.характеризуется следующими свойствами.

Культуральные свойства.

Культивирование гибридных клеток проводят в пластиковых флаконах. По- . севная доза.100 тыс. клеток в 1 мл, плотность в монослое 1х10 клеток на

1 кв.см. Культуру,пассируют как суспензионную в дозе 100 тыс. -клеток в

1 мл 1 раз в 5 дней или в дозе более

100 тыс, клеток в 1 мл 1 раз в 3 дня. 40 Через 3-4 дня в культуральной среде можно, обнаружить моноклональные антитела к коллагенам, концентрация которых составляет 1-,10 мкг/мл в зависи45

,мости от посевной дозы.

Клетки штамма культивируют также в организме животных. Интактным мышам линии ВА1.В/С за 10 дней до иъ 50 ции штамма вводят внутрибрюшинно (в/бр) по 0,5 мл пристана. штамм йнъецируют в/бр. по (1-5) х 10 клеток в 1 мл "среды. Игла. Асцит образовывается через 8-12 дней. Концентрация антитела в асцитной жидкости 1030 мг/мл. Возможна, по крайней мере, двукратная перевивка штамма с сохраФ нением продукции антител.

Стандартные условия культивирования, Среда ДМЕИ с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 2 мИ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/AJI фунгизона, 0,05 мИ 2-меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% углекислого газа.

Характеристика полезного продукта штамма. Итамм продуцирует моноклональные.антитела — иммуноглобулины мыши класса М. Эти антитела специфически связываются с человеческими коллагенами I u III типов. В пределах чувствительности использованных консервация. Клетки штамма консервируют по

1х106 клеток/мл сыворотки крупного рогатого скота с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке из вспененного полистирола с толщиной стенок 1 см. Коробку с ампуо лами оставляют при температуре -70 С и через 1 сут переносят ампулы в жидкий азот для хранения.

Размораживание проводят быстро в водяной бане при 37 С.. Жизнеспособность после размораживания, оцениваемая по включению трипанового синего, составляет не менее 60%.

Контаминация. Контаминация бактериями и грибами в культуре не обнаружена при длительном наблюдении и при посевах на питательные среды. Заражение микоплазмами не выявлено.

II р и м е р 1. Определение связывания антител AmC1 с коллагенами I, III, IV u V типов, фибриногеном, альбумином и фибронектином человека.

Взаимодействие антител АмС1 с раз-. личными антигенами изучают с помощью иммуноферментного метода.

На дно ячеек 96-ячеечной полистироловой панели сорбируют белки, с которыми определяют связывание антител.

Для этого в ячейки вносят по 50 мкл раствора белка с концентрацией 10 мг/мл в 200 мИ бикарбонатном буферном растворе, рН 9,0, и оставляют на 16 ч при 4 С. После пятикратной промывки забуференным физиологическим раствором (ЭФРТ), содержащим 5 мИ NaH F04, 140 мИ Na01, 0,05% твина 20, рН 7,4, в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды от штамма НС1 или раствора

ЭФРТ, содержащих моноклональное антитело АмС1 в различной концентрации, и инкубируют 30 мин при 37 С. Несвя5 16028 завшиеся антитела отмывают ЭФРТ 5 раэ

У в ячейки вносят ковалентно связанные с пероксидазой хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мыши в концентрации 5 мкг/мл в 50 мкл раствора

ЭФРТ. Через 30 мин инкубации при

37 С несвязавшиеся антитела отмывают указанным выше способом, а количество оставшейся в ячейках пероксидазы, пропорциональное количеству молекул антител АмС1, определяют по расщеплению субстрата для пероксидазы (Н О ) в присутствии хромогена — ортофени ендиамина Реакцию оста вл — 15 вают добавлением 50%-ной серной кис Ф лоты до конечной концентрации 57. Интенсивность окрашивания измеряют на микроспектрофотометре при длине волны 490 нм. 20

Результаты свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия антител с коллагенами I u III типов в

30

40

Формула изобретения

Ытамм гибридных культивируемых клеток животных Мцз musculus Ь., ВСКК(П) Р 163Д, используемый для по.— лучения моноклональных антител.к человеческому коллагену I u III типа.

50, Составитель А. Ханыкин

Редактор Н. Киштулинец ТехредЛ.Сердюкова Корректор Л, Пилипенко .

Заказ 3360 Тираж 487 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r,Óæãîðîä, ул. Гагарина, диапазоне исследованных концентраций.

Перекрестная реакция антител с основными компоНентами. соединительной ткани и межклеточного матрикса отсутствует, следовательно, полученные антитела можно использовать для исследования синтеза и экспрессии коллагеном различными клетками человека при культивировании их in vitro для научения распределения коллагенов в раз.личных органах и тканях человека в иммуногистологических исследованиях как в норме, так и при патологии.

Пример 2. Определение связывания антител а АмС! с коллагенами

I, IIE типов человека в присутствие плазмы крови человека.

Сорбцию коллагенов на подложку и исследование реакции взаимодействия проводят, как указано в примере 1.

Иммобилизованные человеческие коллагены I или III типов инкубируют в

-плазме крови человека или в растворе

ЗФРТ 1 ч при 37 С. После этого к коллагенам добавляют антитела АмС1 в различной концентрации соответственно . в плазме крови илн .в ЗФРТ.

67 6

Из данных этого примера следует что присутствие плазмы крови не изменяет связывания исследуемых аптител, с коллагенами Т и III типов по сравнению со связыванием в растворе ЗФРТ и, следовательно, антитела АмС1 могут быть использованы для визуализации мест экспонирования в кровеносном русле коллагенов I и/или III типов и"до ставки в места экспонирования различных эффекторов.

Таким образом предлагаемый штамм

НС1 имеет следующие преимущества: синтезирует моноклональные антитела, взаимодействующие с интерстициальными человеческими коллагенами I u III типов плазма крови не влияет на взаимодействие антител АмС! с коллагенами

I u III типов, Результаты приведенных примеров однозначно свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела АмС1, вырабатываемого штаммом НС1, и показывают возможность использования указанного антитела для исследо.вания синтеза и экспрессии коллагенов различными клетками человека при культивировании их для изучения распределения коллагенов в различных органах и тканях человека в иммуногистологических исследованиях, как в норме, так и при патологии; для визуализации мест экспонирования в кровеносном рус.ле коллагенов 1 и/или III типов и до ставки в места экспонирования различных эффектов. Таким образом, предлагаемое моноклональное антитело имеет ° большое практическое значение и может быть использовано в самом широком круге задач, свяэанных с проблемами биологии и медицины.