Штамм еnтеrоvirussuis для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм нового серотипа энтеровирусов свиней, используемый для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней. Целью изобретения является получение штамма нового серотипа энтеровирусной пневмонии свиней, обладающего репродуктивной активностью в культуре перевиваемых клеток СПЭВ, безвредного и ареактогенного для лабораторных животных. Штамм Ч-73 ENTEROVIRUS SUIS - 15 депонирован в коллекции ВГНКИ код N8, вызывает сероконверсию у кроликов, в гипериммунных кроличьих сыворотках вируснейтрализующие антитела образуются в титре 1:1024. Штамм не вызывает отклонений от физиологической нормы у интравенозно и интрамускулярно инокулированных кроликов. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (51)5 С 12 И 7/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4621471/30-13 (22) 20.12.88 (46) 07.11.90. Бюл. № 41 (71) Украинский научно-исследователь— ский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) В.Ф.Романенко, А.А.Бокун, Н.D.Áàáè÷ и И.H.!!èí÷óê (53) 567.0.094.29 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1362007, кл ° С,12 N 7/00, 1987.

Авторское свидетельство СССР № 1362008, кл. С 12 !! 7/00, 1987. (54) ШТАММ ENTER0VIRUS SUIS ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОВИРУСНОЙ ПНЕВМОНИИ

СВИНЕЙ (57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет соИзобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм нового серотипа энтеровирусов . свиней, используемый для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней.

Цель изобретения — получение нового серотипа штамма энтеровируса свиней, обладающего репродуктивной активностью в культуре перевяваел1ых клеток линии СПЭВ, безвредного и ареактогенного для лабораторных животных, Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГИК!! ветпрепаратов под № 8, назван авторами Ч-73 Е1 rovi—

2 бой штамм нового серотипа энтеро" вирусов свиней, используемый для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней. Целью изобретения является получение штамл1а HOBOI o серотипа энтеровирусной пневмонии свиней, обладающего репродуктивной активностью в культуре перевиваемых клеток СПЭВ, безвредного и ареактогенного для лабораторных животных. Штамм Ч-73 Entегоvirus suis-15 депонирован в коллекции ВГНК!! код № 8, вызывает сероконверсию у кроликов, в гипериммунных кроличьих сыворотках вируснейтрализующие антитела образуются в титре

1:1024. Штамм не вызывает отклонений от физиологической нормы у интравенозно и интрамускулярно инокулированных кроликов. 1 табл..

rus suis-15 и имеет следующие признаки.

Морфоло гия. Сфер иче ск ая форма, типичная для энтеровирусов свиней, имеет икосаэдральную симметрию, размер вириона 26-28 нм.

Антигенная структура. В реакции перекрестной нейтрализации штамм серологически отличается от референтных штаммов известных серотипов энтеро(вирусов свиней.

Биологические свойства. Штамм

Ч-73 Entегоvirus suis-15 обладает репродуктивной активностью на культуре перевиваемых клеток линии СПЭВ и

1604851 накапливается до 107О ТЦД 0>„„â течение 48 ч при 37 С. Обладает бляшко- образующими свойствами на перевиваемых клетках линии СПЭВ. Образует однородные бляшки размером 1-1,5 мм.

Физико-химические свойства. Является РНК-содержащим, репродукция вируса в культуре клеток не подавляет.. ся присутствием в поддерживающей сре- 10 де 100 мкг/мл 5-бром-2-дезоксиуридина на 0,1-1,0 мкг/мл актиномицина Д, устойчив к воздействию хлороформа, эфира и трипсина, а также сред со значением рН 2,0-11,0. Понижает титры на 2-3 1g ТЦД о „после прогревания при 50 С в течение 30-60 мин, Термоустойчив к прогреванию при 50 C в течение 60 мин в присутствии 1 M

Мдс1, 20

Иммуногенность. Вызывает сероконверсию у кроликов; в гипериммунных кроличьих сыворотках вируснейтралиэующие антитела образуются в титре

1:1024 . 25

Безвредность. Не вызывает отклонений от физиологической нормы у интравенозно и интрамускулярно инокулиров анных кроликов.

Диагностику энтеровирусной пневмо- 30 нии свиней проводят путем выделения к идентификации выделенных изолятов вирусов в реакции нейтрализации на культуре клеток СПЭВ, а также выявлением и идентификацией сывороточных антител у больных и переболевших животных.

Пример 1. Использование штамма Ч-73 энтеровируса свиней в качестве антигена для обнаружения и идентификации антител в сыворотках крови больных и переболевших животных, Обнаружение и идентификацию антител проводят в реакции нейтрализации (рН) на культуре клеток, Дпя поста45 новки рН готовят двукратные разведения сывороток в объеме 0,5 мл антигена с содержанием вируса в 0,1 мл

100 ТЦД о. Вирус-сывороточную смесь о выдерживают 1 ч в термостате при 37 С после чего смесь каждого разведения по 0,2 мл вносят в 2-4 пробирки с монослоем культуры клеток, в которых предварительно ростовая среда, заменена íà 0,8 мл поддерживающей. Учет

1 результатов титрования антител проводят на 4-7 сут. Титром антител считают наибольшее разведение сыворотки, которое нейтрализует 100 ТЦД вируса в 50Х инокулированных вируссывороточной смесью пробирках.

Результат считают положительным

I при нарастании титра антител в парных сыворотках в четыре и более раз или при обнаружении титров антител

1:32 и выше в 50 и более процентах сывороток крови переболевших животных.

Пример 2. Обнаружение антигена (вируса) в мазках-отпечатках на патологическом материале методом прямой иммунофлуоресценции .(ИФ).

Для исследования методом иммунофлуоресценции на обезжиренных пред.метных стеклах готовят мазки-отпечатки из свежезамороженного материала.

Препараты высушивают, фиксируют в ацетоне, наносят на них флуоресцирующий иммуноглобулин, помещают во влажную камеру, затем промывают фосфатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Приготовленные препараты исследуют под люминесцентным микроскопом. Положительным ре- < эультатом исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплаэмы клеток на фоне ткани, которая светится серовато-зеленоватым цветом.

Пример 3. Идентификация выделенного вируса в культуре клеток.

Типирование вируса проводят в реакции нейтрализации на культуре клеток с помощью иммунной сыворотки к вирусу штамма Ч-73, входящего в состав набора диагностикумов. Для титрования 0 5 мл вируса с содержанием его в 0,1 мл 1000 ТЦД смешивают с 0,5 мл иммунной сыворотки с содержанием в О, 1 мл ее 20 нейтрализующих доз. После выдерживания вирус-сывороточной смеси в течение

1,5 ч при 37 С по 0,2 мл ее вносят в четыре пробирки с культурой клеток, ростовая среда в которых предварительно заменена на 0,8 мл поддерживающей и ставят в термостат на инкубацию при 37 С. Учет результатов проводят на 4 и 7 сутки.

Результат типирования считают положительным, если в 507 инокулированных вируссывороточной смесью пробирок сыворотка нейтрализовала вирус (ЦПД не отмечено).

Формула изобретения

) Эталонные и выделенные штаммы энтеровирусав

nra- Т80 F59 F34 Г78 F12 F7 У13 К9 К22

ive

Штамм энтеровируса

Ко Л90 М116 Ч73

Г95 Б-111

Ч-73

Составитель И.Тареева

Техред JI.Îëèéíüè

Редактор АЛандор

Корректор И. Эрдейи

Заказ 3435 Тираж 481 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101

5 160485

Пример 4. Идентификация вируса в культуре клеток методом иммунофлуоресценции.

Выращенную на покровных стеклах культуру клеток заражают выделенным вирусом и инкубируют в термостате до появления ЦПД. После наступления.ДПЦ стекла извлекают, промывают фосфатнобуферным раствором, подсушивают и 10 фиксируют ацетоном. Затем на препараты наносят Алуоресцируюший иммуногло. булин к штамму Ч-73, выдерживают

30 мин при 37оС, обильно промывают фосфатно буферным раствором, ополаскивают дистйллированной водой и подсушивают. 11икроскопию проводят на люминесцентном микроскопе.

Положительным результатом считают специфическое ярко-зеленое свечение 20 цитоплазмы клеток в виде фокусов на 3-4 пораженных клеток.

Пример 5. Опыт по определению типовой принадлежности выделенного от свиней штамма энтеровируса 25

Ч-73 в перекрестной реакции нейтрализации в культуре клеток СПЭВ с эталонными и выделенными (Г-95, ;Б-III) штаммами энтеровирусов свиней.

Результаты типирования штамма приведены в таблице.

Данные типирования выделенного штамма энтеровируса свиней Ч-73 с эталонными и выделенными штаммами и изучения антигенного родства между

35 ними доказывают принадлежность его к неизвестному серотипу.

Пример 6. Дпя выделения вирусов от больных свиней отбирают наI 6 зальные смывы, пробы легких, бронхиальных лимфатических узлов, а для вь;— явления антител — сыворотки кров.- от больных и переболевших животных.

Дпя выявления и идентификации сывороточных антител в реакции нейтрализации на культуре клеток используют штаммы известных (Konratice-1;

Т80, F59-2; F34-3; F78-4; F12-5;

F7-6; У13-8; К-9-11; К-22-12;

Л-90-13; И116-14) и нового (Ч-7"-15) серотипов энтеровирусов свиней.

Для типирования выделенных изолятов вирусов используют гипериммунные кроличьи сыворотки к указанным выше штаммам.

Из 70 проб органов и назальных смывов, отобранных в очагах заболевания свиней энтеровирусной пневмонией, выделяют 14 изолятов вирусов, из которых 2 идентичны штамму Ч-73 нового серотипа 15 энтеровирусов свиней.

Из 39 исследованных сывороток крови в 14 выявляют вируснейтрализуюшие антитела в диагностических титрах к штамму антеровируса свиней нового серотипа 15 °

Полученные результаты дают возможность поставить циагноз заболевания свиней энтеровирусной пневмонией и разработать мероприятия по ее профилактикее °

HzmM Entегоvirus suis ВГНКИ Р 8 для диагностики энтеровнрусной пневмонии свиней.