Способ идентификации рыб и их гибридов

 

Изобретение относится к рыбной промышленности, а именно способам идентификации рыб и их гибридов. Целью изобретения является исключение гибели рыб в процессе исследования и ускорение процесса. У исследуемых рыб берут соскоб слизи с наружных поверхностей тела, готовят экстракт белков и подвергают его электрофорезу в полиакриламидном геле, содержащем 4-метилумбеллиферилацетат, при этом электрофорез и сканирование проводят одновременно, затем сопоставляют полученные электрофореграммы со стандартами. 2 табл., 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sl)s А 01 К 61/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4681825/30-13 (22) 24.04.89 (46) 07.12.90, Бюл. М 45 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) B,И.Слынько, С.К,Семенова и П.И.Иванов (53) 639,3.04(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 968902, кл, А 01 К 61/00, 1981. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЫБ И ИХ

ГИБРИДОВ (57) Изобретение относится к рыбной проИзобретение относится к рыбной промышленности, а именно к способам, связанным с идентификацией рыб и их гибридов, а также для прижизненного генетического мониторинга природных и рыбозаводских популяций рыб, Целью изобретения является исключение гибели рыб в процессе исследования и ускорение процесса.

Способ осуществляется следующим образом.

У исследуемых рыб прижизненно берут соскоб колпоидной ткани(слизь) с наружных поверхностей тела в количестве 0,5 мл и смешивают с равным обьемом 20 j ной сахарозы, Отмеряют 20 мкл этого раствора и подвергают его электрофорезу в пластинах полиакриламидного геля, содержащего

0,003,(» флюоресцирующего субстрата 4-метилумбеллиферилацетата, при напряжении

400-500 В в течение 5-10 мин, одновременно облучая электрофорезируемый гель пучком длинноволнового ультрафиолетового света.

Выявляемые таким образом электрофоремышленности, а именно способам идентификации рыб и их гибридов. Целью изобретения является исключение гибели рыб в процессе исследования и ускорение про цесса. У исследуемых pbio берут соскоб сли, зи с наружных поверхностей тела, готовят экстракт белков и подвергают его электрофорезу в полиакриаламидном геле, содержащем 4-метилумбеллиферилацетат, при этом электрофорез и сканирование проводят одновременно, затем сопоставляют полученные электрофореграммы со стандартами.

2 табл„1 ил. граммы видоспецифичного белка эстеразы

Д, присутствующей в исследуемых образцах коллоидной ткани (слизь), сравнивают с известными стандартными электрофоретическими вариантами эстеразы Д соответствующих вид рыб или их гибридов.

Слизь, как ткань, используют из-за наличия в ней белка эстеразы Д, Эстераза Д проявляет видовую специфичность, Присутствие в геле 4-метилумбеллиферилацетата дает возможность одновременно выполнять две операции, которые раньше осуществлялись последовательно — электрофорез и сканирование электрофорезируемого геля в ультрафиолетовом свете.

Наличие в геле флюоресцирующего субстрата обеспечивает образование ферментсубстратного комплекса эстераза

Д 4-метилумбеллиферилацетат в самые первые минуты процесса электрофореза экстракта белков. В свою очередь, этот образовавшийся ферментсубстратный комплекс можно сделать видимым для регистрации, если на

1611303 электрофорезируемый гель направить пучок длинноволновогс ультрафиолетового света.

При использовании предлагаемого способа затраты времени на проведение электрофореза и получение флюоресцирующих электрофореграмм сокращаются; вместо

40 мин по прототипу они составляют 10 lMH по предлагаемому способу, Пример 1, Отбирают из мест обитания ,8 видов рыб. Сведения об исследованных, рыбах приведены в табл.1, У исследуемых особел . помощью глазного скальпеля берут соскоб ксллоидной ткани (слизь) с хвостового плавника. г1олученный образец этой ткани cMBLUMBGIOT c равным обьемом 20%-нсй сахарозы и 20 мкл этого белкового раствора вносят в лунку пс" лиакриламидного геля, который содержит

0,003% флюоресцирующего субстрата 4-метилумбеллиферилацетата. Затем в течение

1G мин на гель подают напряжение 500 В постоянного тока и одновременно облучают злектрофорезируемый гел ь пучком дг и и новолнового ультрафиолетового светя, При таком сканировании в геле видны четкие флюоресцирующие электрофсретические вярианты эстеразы Д анализируемых видоь рыб в виде дискретных полос, которые сопоставпягот с известными стандартными эпектрофоретическими вариантами эстеразы Д этих видов, Ка чертеже предсгавпены результаты видовой идентификации рь б. Ка чертеже изображено: — атлантический лосось; I!-кумжа; ill — гибриды лосось х кумжа; !Ч— минога; Ч вЂ” сингиль (кефаль); И вЂ” плотва; Vil— елец; Иl! — карп.

Пример 2. Ка pblooÂoäèoì заводе провели ряд индивидуальн ix скрещиваний между лососем (Salmo за!аг L,) и кумжей (Salmo тгитта L.) с целью про ведения генетического анализа на эстерязе Д, Для этого у отловленных в реке производителей, находившихся в преднерестовам состоянии, с помощью скальпеля брали соскоб колпоидной ткани (слизь) с хвостового плавника.

При этом к спинному плавнику каждой оаследуемой особи прикрепляли подвесную метку, на которой указан порядковьлл . .омер. Затем его регистрировали в протоколе опыта. Взятый образец коллоидной ткани подвергали электрофоретическому анализу .и определяли видовую принадлежность данной пронумерованной особи способом, указанным в примере 1, Полученный результат аидовой идентификации регистрлровали в протоколе. Этим спо:îáîì было проанализировано 8 рыб (производителей)-4 лосося и 4 кумжи. Затем осуществляли

35 подбор родительских пар и проводили индивидуальные скрещивания по следующей схеме: 1) лосось х; 2) кумжа х кумжа;

3) лосось х кумжа; 4) лосось х кумжа. Оплодотворенную икру, полученную в каждом скрещивании, помещали на инкубацию в отдельные садки с тем, чтобы избежать ее случайного смешивания. Сразу же после оплодотворения икры молоками у родительских особей были взяты навески скелетных мышц для осуществления видовой идентификации по прототипу. Затем сопоставляли результаты анализа коллоидной ткани (слизь) и скелетных мышц. этих родительских особей.

Было обнаружено, что у каждой отдельной особи электрофоретические варианты эстеразы Д, полученные предложенным и известным способами, идентичны. Эти результаты были подтверждены также данными генетического анализа потомства, произведенного от указанных родительских пар. После достижения потомством возрастной стадии "малек", оно бь лс подвергнуто электрофоретическому анализу с целью выявления электрофореграмм зстеразы Д известным способом, Полученные у мальков электрофоретические варианты эстеразы Д в каждом отдельном скрещивании соответствуют ожидаемым вариантам эстеразы Д, что находится в полном согласии с законами наследования дискретных качественных признаков и доказывает правильность идентификации родительских особей предлагаемым способом, Результаты анализа родительских пар и их потомства приведены в табл,2.

Формула изобретения

Способ идентификации рыб и их гибридов, включающий взятие у рыб образцов тканей, приготовление экстракта белков из этих тканей, электрофорез экстракта белков э попиакриламидном геле, инкубирование геля в растворе 4-метилумбеллиферилацетате, получение элактрофореграмм путем сканирования геля в ультрафиолетовом свете и сопоставление последних со стандартами, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью исключения гибели рыб в процессе исследования и ускорения процесса, в качестве ткани для приготовления экстракта белков используют слизь, взятую путем соскоба с наружной поверхности тела, а из полиакрил="Mèäíîãî геля для злектрофореза исI0Jlb3vioT гели из полиакриламидного геля, . содержащего 4-метилумбеллиферилацетат, при этом электрофорез и сканирование проводят одновременно.

1611303

Таблица 1

Обьем выборки

Вид

Место обитания

И енти ика ия поспособ известном и е лагаемом

Реки и озера

500

400

400

400

Гибриды лосось х кумжа

Минога

Сингиль

Гибриды лосось х кумжа

Минога

Сингиль

462

100

Реки

Реки

Рыбопитомник

180

Плотва

Елец

Ка и

Плотва

Елец

Ка и

+ — производители; — молодь.

Таблица 2

Составитель Т,Красюкова

Техред М.Моргентал Корректор Т.Палий,Редактор А.Шандор

Заказ 3781 Тираж 443 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Атлантический

ЛОСОСЬ

Атлантический

ЛОСОСЬ

Кумжа

Гибриды

Нлосось х кумжа

Минога

Сингиль+ (кефаль

Плотва

Елец

Ка и

Рыбоводные заводы

Рыбоводные заводы

Рыбоводные заводы

Реки

Море

Атлантический лосось

Атлантический лосось

Кумжа

Атлантический лосось

Атлантический лосось

Кумжа