Способ определения численности углеводородокисляющих бактерий

 

Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть использовано для бактериологического анализа природных сточных вод, а именно донных отложений. Целью изобретения является повышение точности способа . Способ заключается в фильтровании через мембранный фильтр пробы воды или разведений водной вытяжки из грунта, нанесении на фильтрующую поверхность фильтра тонкого слоя углеводорода или их смеси, размещении фильтра на пористой подложке, увлажненной минеральной средой, и культивировании при 20-21°С. Учет микроколоний на фильтре ведут под микроскопом после 2-3 и 5-6 суток культивирования , что позволяет дифференцированно учитывать бактерии, способные к активному и медленному окислению углеводородов . 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСГИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4609215/13 (22) 23. ) 1. 88 (46) 23,02.91. Бюп. ¹ 7 (71) Днепропетровский государственный университет им. 300-летия воссоеди— нения Украины с Россией (72) В. П. Чекалов (53) 663. 15 (088.8) (56) Руководство по методам анализа морской воды и донных отложений . — Л,: Гидрометеоиздат, 1980, с. 56-60.

Straskrabova V. Ие&ойз for counting water bacteria-comparison and

significance, - Acta hydrochim., hydrobio1,, 1973, v. 1, № 5, р. 433 — 454. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕ1ИЯ ЧИСЛЕННОСТИ

УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть исИзобретение относится к санитарной микробиологии и может быть использовано для бактериологического анализа природных сточных вод и особенно донных отложений.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ заключается в следующем.

Готовят ряд последовательных разведений пробы грунта 10 10 у 10 4 Если анализу подвергают воду, то к разведению пробы можно не прибегать. Из каждого разведения отфильтровывают определенный объем воды через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2О, 3 мкм. Фильтры предварительно кипятят в дистиллированной воде до 10 раэ и стерилиэуют в автоклаве при 1,2 атм (S1)g С 12 Q 1/06, С 12 и 1/20 пользовано для бактериологического анализа природных сточных вод, а именно донных отложений. Целью изобретения является повышение точности способа, Способ заключается в фильтровании через мембранный фильтр пробы воды или разведений водной вытяжки из грунта, нанесении на фильтрующую поверхность фильтра тонкого слоя углеводорода или их смеси, размещении фильтра на пористой подложке, увлажненной минеральной средой, и культивировании при 20-21 С. Учет микроколоний на фильтре ведут под микроскопом после 2-3 и 5-6 суток культивирования, что позволяет дифференцированно учитыв ат ь б актерии, спо с об ные к активному и медленному окислению углеводородов, 1 табл, в течение 40 мин. Перед фильтрованием разведений новой пробы Зейтца р@ воронку протирают тампоном, смоченным спиртоМ, и обжигают в пламени горелки. Фильтровать начинают с максимального разведения, после чего обра ботку воронки спиртом дпя последующих разведений не производят, Фильтры фильтрукщей поверхностью погружают на 2-3 с в капельки стерильной нефти, нанесенные на дно чашки

Петри. Для каждого фильтра желатель- но использовать отдельную каплю нефти. Далее их переносят на пористую поверхность подложки, в качестве которой можно применять поролон. Подложки толщиной 5 мм подготавливают к работе аналогично фильтрам (кипятят

1629318 до 10 раэ и стерилизуют при 1,2 атм в течение 40 мин), после чего помещают на дно стерильной чашки Петри, в которую заливают минерапьную среду, например среду Диановой-Ворошиловой, В одной чашке можно расположить до

3-4 подложек и, соответственно, фильтров, Посевы инкубируют при 21 С. Учет выросших колоний производят под микроскопом при увеличении 120 раэ (8х 1, 5 к!О) в 10 полях зрения с последукщим пересчетом на 1 мл исходной про бы. Кало нии ко нтр аст но выделяют ся на фо не нефтепродукта, что поэ воляет избегать окрашивания фильтра зритрозином, сохраняя живыми культуры микро ор ганиз мов.

Р асчет числе нности углеводород- 20 окисляющих бактерий проводят при подсчете колоний на всех фильтрах, усредняя полученные значения, либо по одному из фильтров при сливном росте или, наоборот, низкой концентрации 25 колоний на других фильтрах.

Появление колоний на фильтре отмечается через 2-3 сут;

Учет колоний на фильтрах в процессе инкубирования приведен в табли-30 це.

Бактерии, которые в естественной среде адаптированы к использованию углеводородов в качестве субстрата„ т, е, имеющие соответствующую фермент-35 ную систему, опережают по темпам роста бактерии, вынужденные синтезировать соответствующую ферментную систему. Активные углеводородокисляющие бактерии формируют колонии через 2- 40

3 сут, тогда как бактерии, потенциально способные утилизировать углеводороды, завершают формирование ко поний через 5-6 сут.

Пример. 1 мл пробы воды про- 45 фильтровывают через мембранный фильтр с диаметром пор О, 2-0, 3 мкм. Фильтр предварительно кипятят в дистиллированной воде и стерилизуют в автоклаве нри 1,2 атм в течение 40 мин.

После окончания фильтрования пробы мембранный фильтр фильтрукщей по верхностью погружают íà 2-3 с в капсльку стерильной нефти, нанесенную на дно чашки Петри. Далее фильтр переносят на пористую поверхность подложки толщиной 5 мм, в качестве которой используют поролон, Подложку, подготовленную так же, как и фильтр, помещают на дно чашки Петри, в которую запивают минеральную среду следующего состава, г/л: KNO> 2,0; КН РО !.

0,6; Ма НРО "12H O 1,4; И9504 7Н О

0,8; ИПS04 1!Н<0 О, l, FeSO «7Н О следы, вода водопроводная, рН 6,9-7,2.

Чашки Петри инкубируют при 21 С, Выросшие на фильтре микроколонии подсчитывают под микроскопом при увеличении 120 раэ в 10 полях зрения с последукщим пересчетом на 1 мп исходной пробы, После 2 сут инкубирования количество выросших микроколоний на фильтре соответствует 7, 1 ° 10 клеток/мп, после 6 сут. — 59,1 10

Предлагаемый способ позволяет проводить учет численности активной и потенциальной углеводород-окисляющей микрофпоры, при этом сохраняется жизнеспособность культур микроорганизмов, вследствие контрастирования:. колоний на фильтре углеводородным субстратом, а не химическим красителем, Формул а из о бр ет ения

Способ определения численности углеводородокислякщих. бактерий, предусматривающий фильтрацию через мембранный фильтр пробы воды или разведений водной вытяжки из грунта, размещение фильтра на увлажненной пористой годложке, инкубирование и учет выросших микроколоний под микроскопом через определенное время, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, подложку предварительно увлажняют минеральной средой, а на фильтрукщую поверхность фильтра наносят тонкий спой углеводородного субстрата, при этом после 2-3 суток инкубирования проводят учет бактерий, активно окисляющих углеводороды, а

-после 5-6 суток — медленно окисляющих углеводороды.! 629318 6

Количество колоний, (кпеток), на 1 г грунта (к 10 ) через время, сут

2 3 4 5 6 7

63,1

219,0

7.1

П р и м е ч, à h и е,"-" — отсутствие роста или регистрации результата

Составитель Л. Минеева

Техред A. Кравчук

Редактор Н. Гунько

Корректор И. Муска

Заказ 410 Тираж 362 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5 1роизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Проба

42,1

15,1

198,0

5l 0

208,0

59,1