Способ получения десульфатогирудина

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к получению чужеродных полипептидов в дрожжевых клетках. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта . Способ заключается в том, что; конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую синтез десульфатогирудина путем объединения BamHI- Sall фрагмента векторной плазмиды р,Л)В20С размером 6,3 kb с гибридным промотором PH05-GAPDH, состоящим из BamHT-BstEHPH05-d parMeHTa плазмиды р 31/Y, связанного линкерами BglTI с промоторным фрагментом Bglll- EcoRIGAPDH плазмиды pGPDH-E и Hgal- BamKI-фрагментом плазмиды pMT350L размером 0,2 kb, кодирую;щм десульфатогирудин. Штамм Ј. cerevisiae GRF18 трансформируют полученной ДНК, культивируют клетки в среде, содержащей 0,03 г/л дисульфатиридина. 4 табл. § (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (Sl)S С Г2 Ь 15/15

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ьйьлио

К IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4028035/13 (22) 28.08.86 (31) 8521496 (32) 29.08.85 (33) GB (46) 23.02.91. Бюл, Р 7 (71) Циба-Гейги АГ (СН) (72) Альберт Хиннен (СН) и Бернд

Мейхак (DE) (53) 575. 224. 2: 577.? (048) (088. 8) (56) Nethods in Fnzymology, 1976, 45 р. 669-678. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению чужеродных..полипептидов в дрожжевых клетках. IIeëüþ изобретения являИзобретение относится к биотех; нологии, в частности к получению чужеродных полипептидов в дрожжевых клетках.

Цель изобретения повышение выхо- да целевого продукта.

Способ заключается в том, что конструируют рекомбинантную плазмидную

ДНК, содержащую гибридные промотор

РНО5-ГАРВН, состоящий из Clo-SalI

РН05, промоторного фрагмента плазми, ды р 31/Y размером 545 Ьр, связайного синтетическим линкером Вр11Х с BglIIEcoRIGAPDH промоторным фрагментом .йлазмиды pGADH размером 266 Ьр Sal IHind III-фрагмент плазмиды pIDB207/, /205-HIP размером 6,3 kb u

FcoRI-HindIIJ-фрагмент плазмиды

pJDB207/рН05(ЕС0)HIR размером 643 bp

„„SU„„1630616 А 3 ется повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в том, что; конструируют.рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую синтез десульфатогирудина путем объединения BamHISall фрагмента векторной плазмиды

pJDB20C размером 6,3 kb с гибридным промотором РН05-GAPDH, состоящим из BamHI.-BstFHPH05-фрагмента плазмиды р 31/У, связанного линкерами

BglII с промоторным фрагментом BglIIFcoKIGAPDH плазмиды рСРВН-F. u HgaIBamHI-фрагментом плазмиды рМХ310L размером 0,2 kb, кодир ющим десульфатогирудин. Штамм S. cerevisiae

GRFI8 трансформируют полученной ДНК, культивируют клетки в среде, содержащей 0,03 г/л дисульфатиридина.

4 табл. содержащий дисульфатогирудин HgalBamIII-фрагмент плазмиды р1П,3101. раз-, мером 0,2 kb трансформируют полученной рекомбинантной плазмидной ДНК итамм дрожжей S.cerevisiae GR1 18, культивируют трансформированные клетки, в жидкой культуральной среде, содержащей О, 03 г/л дегидрогенфосфата калия.

Пример 1. Конструировачие

РН05 промоторных делеций, а) Âàl31 расщепление. Рекомбинантный фаг М13мр9/НРО5 Bam-Sal, содержащий BamHI-Sall †ôðàãìå РН05, используют в качестве источника

РН05 промотора, 20 кг фага ДНК (RF: репликативная форма) расщепляют ре1630616

25 стрикционной эндонуклеазой SalI, получая линейную ДНК приблизительно

9 Г:Ь, После экстрагирования смесью фенол/хлороформ ДНК осаждают этано5 лом. ДНК повторно суспендируют в

10 мМ трис, рН 8,0„ в концентрации

0,5 мкг/мл. 16 мк ДНК, отщепленной

SalТ, расщепляют 2 eg экзонуклеазы

ВА131(BPL) в 100 мл 20 мМ трис, 10 рН 8,0, 199 мм NaC1., 12 мМ MgClg, 12 мМ СаС1 и 1гФ ЭДТА. Лликвотные части 2 мкг ДНК каждая отбирают после 1, 2, 3, 4, 5 и 6 мин инкубирования при 30 С и немедленно смешивают с 15

50 мкл фенола и 60 мкл TNE. После экстрагирования смесью фенол/хлороформ и осаждения этанолом, ДНК повторно суспендируют в 1 0 мМ трис, рН 8,0, при концентрации 100 мкг/мл, Для анализа степени экзонуклеолитического отщепления Ва131 0,5 мкг ДНК для каждого момента времени расщепляют эндонуклеазой БашНТ и анализи, руют на 1,57.-ном агарозном геле в трис-боратном буфере, рН 8,3 (90 мМ трис-НС1, рН 9,3, 90 мМ борной кислоты, 2,5 мГ1 ЕДТЛ). В среднем 100 bp удаляют с каждого конца фрагмента за

1 мин Ба131 расщепления.

30 б) Добавление EcoRI линкеров к обработанной Ва1.31 ДНК. Две ед.A gap

ЕсоКТ линкеров (5 -GGAATTCC-3, BRL) повторно суспендируют в 250 мкл 10 мМ трис-НС1, рН 8, 1 мМ ЕДТА. 2 мкг

EcoRI линкеров обрабатывают киназой в в 75 мкл 60 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ МИКСТg, 15 мМ ДДТ, 10 мкМ ATP и 33 ед.Т4 полинуклеотидной киназы.

Через 1 ч при 37 С смеси дают остыть ц до комнатной температуры, а затем хранят при -?О С, о.

Отожженные двунитевые EcoRI линкеры связывают тупыми концами с ДНКфрагментами, обработанными Ва131, 45

0,5 мкг ДИ(, обработанной Ра131, инкубируют в течение 16 ч при комнатной температуре с 50-кратным избытком

EcoRI линкеров, обработанных киназой и 20 мкл 60 мМ тряс, рН 7,5, 10 мМ

MgClg, 10 мМ ДТТ, 4 мМ АТР и 600 ep,,Q

ДНК-лигазы, После инактивирования

Т4. лигазы (10 мин при 65 С) избыток

FcoRI линкеров отщепляют 50 ед. FcoRI в Объеме 50 мкл. ДНК экстрагируют смесью < .енол/хлороформ, .осаждают эта-.

55 нолом н повторно сусиендируют в 10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЕДТА (-TF). Затем ДНК отщепляют 5 ед. ВашНТ и полученную смесь вносят в 1,57.-ный агарозный гель с низкой температурой плавления в трис-боратном буфере. Полосы охра-/ шивают этидиумбромидом и визуализи-, руют длинноволновым УФ-светом при .

366 нм. 1Чирокие диффузные полосы между около 100 п.о, и 600 п.о. вырезают из геля, и ДНК экстрагируют. . в) Лигирование в M13мр9. 3 мкг

М13мр9 расщепляют 15 ед. FcoRT.è 15 ед.

BamHI в объеме 50 мкл, После экстрагирования фенолом и осаждения этанолом ДНК повторно суспендируют в

50 мкл ТЕ. 5 мкл отрезков векторной

ДНК (около 200 нг) смешивают с 10 мкл

I указанных образцов (ДНК-фрагменты, полученные из различных Ва131 переваров, как описано в примере 1б) и лигируют в полном объеме 20 мкл в присутствии 60 мМ трис-НС1, рН 7,5, 6 мМ YigClq, 100 мМ ДТТ, 1 MM ATP u и 200 ед,Т 4 ДНК-лигазы в течение

15 ч проводят трансдукцию компетент ных клеток штамма Е,coli Yi101. Фаги выращивают и анализируют по размеру их ДНК-вставок путем отщепления рестрикционными ферментами EcoRI u

BamHI. г) Определение Ва131 конечных точек делеции определением последовательности аминокислотных остатков по

Сангеру (делеции Sall сайта). Определение последовательностей проводят, используя систему дидеокси-ДНКопределения последовательностей.

Конечные точки делеции приведены в табл,1. д) Определение Ва131 конечных точек делеции определением последова- . тельности аминокислотных остатков по

Сангеру (делепии от BamHI сайта), Осуществляют аналогичный набор Ва131 делеций, как описано в пунктах а-в

3а исключением того, что M13мр9 РН05

Bam-Яаl вырезают с помощью BamHI.

Ва131 расщепленные фрагменты обрабатывают EcoRI u SalI и полученные фрагменты клонируют в М13мр9 расщепленный EcoRI u SalI. Конечные точки делеции приведены в табл.2, е) Конструирование внутренних

РН05 промоторных делеций. Набор Ва131 делеций, описанный под пунктом r

i приводит к получению "левых" РНО5 1 промоторных фрагментов, заканчивающихся EcoRI сайтом, а Ва131 набор делеций, описанный в пункте д, приводит к получению "правых" РН005 про -., 5

1бЗОб1 моторных фрагментов, заканчивающихся

EcoRI-сайтом, Комбинируя "левые" и

1! и правые в различных положениях создают внутренние делеции, которые

5 содержат EcoRI линкерный сегмент по сайту делетированной ДНК. Отдельные внутренние делеции конструируют, вырезая "левые" и "правые" из M13ìð9 производных рестрикционными эндонуклеазами EcoRI u BamHI ("левые") или

EcoRI u SalI ("правые") и выделяя соответствующие фрагменты с помощью электрофореза в мягком агарозном геле, как описано в пункте б. Эквимоляр-!5 ные количества левых, правых и

200 нг BamHI u SalI расщепленных

М13мр9 векторных ДНК лигируют, КаК описано в пункте в. После трансдукции в Е.coli М101 белые пятна отби- 20 рают, определяют RF и анализируют рестрикционным ферментативным анализом (BamHI, SalI, FcoRI). Куски, приведенные в табл.3, объединяют для создания специфических внутрен- 25 них делеций.

Пример 2. In vivo анализ внутренних делеций РН05 промотора.

Различные делеции, описанные в 30 ,примере 1 клонируют в плаэмиду

pJDB207(PH05), заменяя дикий тип

PH05 Bam-Sal фрагмента делетированным вариантом. После трансформации дрожжевого штамма S.cerevisiae АН216., определяют активность кислой фосфатаэы. Анализ показывает, что три зоны, существенные для РН05 экспрессии, расположены в следующих положениях:

1, между положениями -349 и

-383 (ИА$1)

2. между положениями -225 и

-263 (ИА$2);

3, между положениями -87 и

-125 (ТАТА бокс).

ДНК фрагменты, содержащие HAS> или

ИА$2 или ИАБ1 и ИА$2 РН05 можно получить из рекомбинантного фага M13мр9 (PH05) путем отщепления соответствующими эндонуклеазами, Пример 3. Конструирование слитых PH05-GAPDH гибридных промоторов.

В примерах 1 и 2 конструируют участки вокруг положений -365 ИА$1 (РН05) и другой участок вокруг положения -180 ИАБ2 (РН05) РН05 гена— возможные кандидаты для HAS с регулиб

6 руемыми функциями. ИАБ1 (РНО5) содер-. жится в 268 п.о. BamHI-Cla-фрагменте, тогда как оба ИАБ! (PH05), и

ИА$2 (PH05) содержатся в 368 п.о.

BamHI-BstFII-фрагменте, Каждые два этих фрагмента сливают с двумя различными GAPDH, которые включают ТАТА бокс и сайты инициирования транскрипции GAPDH. а) Конструирование дрожжевой ген-. ной библиотеки . 30 мкг полной высокомолекулярной ДНК дрожжей дикого типа штамма S288C инкубируют в течение

30,мин при 37 С с 2 ед. EcoRI метилазы в 250 мкл EcoRI буфера метилирования. ДНК осаждают этанолом, повторно суспендируют в 500 мкл 25 мМ трис-НС1, рН 8,5, 2 мМ MgClq (EcoRI» буфер) и расщепляют EcoRI до тех пор, пока не получат распределение фрагментов ДНК по размерам с максимумом в области 30-50 т.п.о. Дрожжевые ДНК, расщепленные в условиях EcoRI

К фракционируют по размерам в градиенте сахарозы (5-201 сахарозы в

10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 1 мМ ЕДТА).

30 фракций по 0,4 мл каждая собирают с верхнего значения градиента, Фракция 16 содержит ДНК-фрагменты размеом по 30-40 т.п.о. ДНК этой фракции

3 мкг) осаждают этанолом и лигируют в течение 16 ч при 15 C в полном объеме 15 мкл с 15 мкг космидного вектора рУсХ, линеаризированного

EcoRI. Лигирование проводят 300 ед.Т

ДНК-лигазы, используя описанную буферную систему. ДНК упаковывается

in vitro в бактериофаг Я/В, а собранные фаги используют для трансдукции

Е.coli штамма НВ101 (rk, mk, lm

pro, гес А), Эффективность трансдукции составляет около 5000 устойчивых к ампициллину колоний на мкг pYcl вектора. 300 amp . колоний отбирают и выращивают в LB среде, б) Выделение дрожжевого GAPDH гена. Описанную генную библиотеку скринируют синтетическим: олигонуклеотидом следующего строения: 5

ССТССАТСТТССАССССССС-3

10 мкг олигонуклеотида обрабатывают киназой, используя 1О мкл 32р-АТР (3000 Кюри/ммоль, 10 мкКюри/мкл Т полинуклеотидной, киназой. Положительное клонирование детектируют авторадиографически. Выделение плазмид" ной ДНК приводит к получению гибрид-. ного клона, который содержит

1 630616

Нуклеотидная последовательность, кодирующая десульАатогирудин, начинается с GTT-кодона, стоящего после

ИН -терминального валина в конечном продукте. Для удобного субклонирования и экспрессирования в F,.colj коf дирую(Чую последовательность продолf жают на 5 -окончании с помощью восьми нуклеотидон, включающих EcoRI-ограничительный участок и АТС-инициирующий кодон. Для точного скелетного слияния гирудиновой кодирующей после55 довательности с последовательностью кодирующей РН05 сигнальный пеп гид, эти дополнительные нуклеотиды удаля2100 и.o. HindIII. фрагмента, кодирующего GAPDH. Клонированный GAPDH ген имеет ту же самую последователь- ность, что и pgap 491.

5 в) Получение АХАРОН расположенных ниже промоторных. 649 п.î, Tagl-фрагмента, который включает положения от 27 до 675 от ATG GAPDH гена выделяют, расщепляя гибридную плаэмиду 10

ТаяТ, выделяя ДБК-фрагмент на 1,3Хном мягком агарозном геле и экстрагируя ДНК горячим фенолом, Клонирование Tagl-фрагмента проводят в Clalсайт рВКЗ?2. 1 мкг pBR322 отщеп- 15 ляют тремя единицами Clal. 300 нг лигируют примерно с 300 нг вставки

ДНК (649 bp ТаяТ-фрагмент), используя 200 ед.Т(, ДНК-лигазы в 20 мкл, Трансформирование проводят в F,.coli 20

НВ101 на устойчивость к ампициллину. П((азмидную ДНК получают и анализируют рестрикционным анализом, Ориентацию Tagl-фрагмента устанавливают, используя рестрикционную эндонуклеазу

IIraI в сочетании с BamHI. Выбирают плазмиду, которая содержит Tagl сайт положения -675 вблизи HindIII-сайта

pRR322. Эту плазмиду, обозначенную рВР322/GAPDH, линеаризируют, исполь- 30 зуя BamHI, а расщепление Ва131 осуществляют, как, описано в примере 1, за исключением того, что используют

Вя1ll-линкеры, Размер Ва131 укороченного Tagl-фрагмента определяют рестрикционным анализом (используя

BglII и.Hindlll).

Пример 4. Экспрессирование десульфатогирудина, контролируемое PH05-GAPDH гибридным промотором. 40

I. Регулирование нуклеотидной последовательности на 5 -окончании десульфатогирудинового Н, V, R гена. ют путем измерения ЕсоК1-ограничительного участка в участок растущего окончания, добавления синтетического олигонуклеотида, содержащего участок распознавания HgAI в таком положении, что последующее расщепление с помощью Hgal происходит непосредственно сверху от GTT-кодона, . Ведение Hgal ограничительного участка перед десульфатогирудиновым геном. 8 мкг плазмиды pNL310 (FP

168342) исчерпывающе расщепляют с помощью ограничительной эндонуклеазы EcoRI ДНК, экстрагируют системой фенол/хлороформ и осаждают этанолом, Выступающие концы в положении 5 уда( ляют нуклеазой S(. ДНК pNI.310/EcoRI в количестве 4 мкг расщепляют в

100 мл смеси, состоящей из ?50 мМ

NaC1, 1 мМ ZnSOq, 30 мМ ацетата натрия при рН 4,6.с помощью 20,ед./мл нуклеазы Б((Сигма) в течение 45 мин при 37 оС .

ДНК экстрагируют смесью фонол/хлороформ и осаждают этанолом. ДНК (pNL310/EcoRI/S1 повторно суспендируют в 100 мкл раствора, содержащего

50 мМ трис-НС1 рН 8,0, и инкубируют в присутствии 2 ед, щелочной фосфатазы кишечника теленка в течение 1 ч при 37 С, Энзим инактивируют в течение 1,5 ч при 65 С, Концентрацию NaC1 в инкубационной смеси устанавливают равной 150 мМ, Дефосфорилированную ДНК (pML310/

EcoRI/S /ClAP) очищают путем адсорбции на ионообменной;колонке ДН52 в буфере с низким содержанием солей (150 мМ МаС1, 10 MN трис-НС1, рН 8,01

1 мМ ЕДТА) и затем элюируют буферным раствором с высоким содержанием солей (1,5 мМ NaC1, 10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА), ДНК осаждают этанолом и повторно суспендируют в НдО в концентрации 0,8 мг/мл.

Олигонуклеотид формулы 5

AGCGTCGACCCT-3 синтезируют фосфотриэфйрным методом. Получают самокомплементарную последовательность олигонуклеотидов, содержащую участок распознавания -САССС-ограничительной эндонуклеазы НдА1. Отжиг двух одинарных нитей приводит к получению двунитевой ДНК-связки иэ 12 пар азотис-, ть1х оснований.

Синтетический однонитевой олигодеоксинуклеотид в количестве 1,2 мкг

1630616

l0 фосфорилируют в 10 мкл системы, состоящей из 60 мМ трис-НС1 с рН 7, 5, 10 мМ YigClq, 5 M МДТТ, 30/I Ci (g-32p)

АТР (3000 Ci ммоль и 6 ед.Т,1 поли-.

5 нуклеотидекиназы в течение 30 мин

0 при 37 С с последующим замещением в течение 15 мин в присутствии 0,5 мМ

ATP. Полученную смесь дополнительно инкубируют в течение 10 мин при 75 С с целью инактивации энзима и затем охлаждают до комнатной температуры для отжига.

Меченную по э Р ДНК-связку в количестве 0,6 мкг (170 пмоля) смешивают с 2,4 мкг (1 75 пмолей концов)

pM1310/FcoRI(Б<)CIAP. и лигатируют в

20 мл смеси, состоящей из 60 мМ трис-НС1, рН ?,5, 10 мМ MgClq, 5 MN

ДТТ> 3.5 мМ АТР> 800 ед.7 1 ЛНК-лигазы, в течение 20 ч при 150 С. Лигазу инактивируют в течение 1 О мин при 85 С и избыток молекул связки о удаляют осаждением ДНК в присутствии

10 мМ ЭДТА с рН 7,5, 300 мМ ацетата 25 натрия с рН 6,0 и 0,54 объемов изопропанола, Через 30 мин пребывания при комнатной температуре ДНК суспендируют в 45 мкл лигатационной смеси и лигнируют в течение 6 ч при 15 С 3р с образованием кольцевой ДНК, Аликвоты лигазной смеси объемами

1 и 3 мл добавляют к 100 мл обработанных кальцием трансформационных компетентных клеток Е.coli HBl 01. Клетки оставляют охлаждаться во льду на

30 мин, затем инкубируют в течение

3 мин при 4?ОС, охлаждают в течение

2 мин во льду и инкубируют в течение

l ч при 37 С в 400 мкл среды SOS. 40

Полученные клетки концентрируют до объема 100 мкл и наносят на пластины с LB агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, 45

Двенадцать трансформированных amp колоний индивидуально выращивают в среде LH содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Готовят плазмидную ДНК, Наличие синтетической олигонуклеотидной связки подтверждают определением последовательности аминокислотных остатков с использованием фрагмента однонитевой ДНК-затравки, которая гибридизуется с кодирующей нитью

55 гирудина. Клон, который содержит

ДНК-связку в.правильном положении впереди гирудинового гена, обозначен как pML3IOL.

II. Слияние Ph05 сигнальной последовательности десульфатогирудино= вого структурного гена. . а) Выделение десульфатогирудинового фрагмента. 12 мкг ДНК-плаэмиды

pL31OL исчерпывающе расщепляют эндонуклеазами BamHI u Pyul. После экстракции ДНК два укаэанных ограничительных фрагмента отделяют в 1,27.— ном агарозном геле в трис-борат-ЕДТА буфере, рН 8,3. Из геля выделяют

PyuI- ВатНТ-фрагмент размером 0,84 п.о.

ДНК элюируют;

-Pyu-BamHI-фрагмент pNI31 OL дополнительно расщепляют с помощью эндонуклеаэы Hgal. В результате расщепления образовывается Hgal-BamHI-фраг" мент размером 198 п.о., который содержит полную кодирующую последовательность для зрелого десульфатогирудина. Дополнительное расщепление с помощью AIHI не затрагивает этого фрагмента, но устраняет другой Hgalфрагмент аналогичного размера.

Нужный hgal-BamHI-фрагмент отделяют от других фрагментов на 1„57-ном агарозном геле в ТВЕ буфере и элюируют. ДНК очищают ионообменной хроматографией, осаждают этанолом, ДНК повторно суспендируют в НдО в концентрации 30 мкг/мл (Ор2 пмоль/мкл)..

Выделение Ph05 промоторного участка с частью РН05 сигнальной последовательности, Плазмида p31/РН05-ТРА18 имеет.РН05-промотор и РН05-сигнальную последовательность, скелетно связанную с инородным структурным геном (t-PA), Фрагмент 584 п.о. BamHI-BaII содержит РН05-промотор и всю РН05-сигнальную последовательность, но с восемью нуклеотнцами на 3 окончании. р3)/РН05-ТРА18 ДНК в количестве

8 мкг расщепляют эндонуклеазой HalI (16 ч при 37 С). ДНК очищают путем экстракции смесью фенол/хлороформ и осаждением этанолом, ДНК повторно суспендируют в НрО при концентрации

0,7 мг/мл, Правильное соединение между РН05 сигнальной последовательностью и кодирующим участком десульфатогирудина обеспечивается синтетической связкой формулы:

Ф (1) 5 -CCAATCGA-3

Я р (2) 3 -GGTTAGGT СААСА-S

Восемь нуклеотидов на 5 оконI чании связи (5 -CCAATCCA) представляют собой часть РН05-сигнальной по-!

1630616

40 следовательности от участка BalI до прецессионного участка. Пять нуклеотидов, выступающих над окончанием 5 .

1 олигонуклеотида (2), соединяются с участком HgAI расщепления на 5 . окончании десульфатогирудиновой кодирующей последовательности, Индивидуальные однонитевые олигонуклеотиды (1) и (2) синтезируют 10 фосфотриэфирным методом. Олигонуклеотиды (1) и (2) в количестве

1,1 мкг и 1,8 мкг соответственно индивидуально фосфорилируют на их 5 окончаниях, смещивают в эквимолярных количествах и отжигают.

3 1 осфорилированную двунитевую

ДНК-связку в количестве 1„3 мкг (200 пмоль) лигируют с 7 мг (1,8пмоль) 1> р3Т/РН05-ТРА18 расщепленной с помо†20 щью BalI в 40 мл смеси, состоящей из

60 мМ трис-hrl, рН 7,5, 1О мМ MgCl<, 3,5 мМ АТР, 5 мМ ДТТ и 1400 ед.Т, ДНК-лигазы, при 15 С в течение 16 ч. Лигазу инактивируют в течение 10 мин 25 ( при 85 С. Избыток связок удаляют осаждением ДНК в присутствии 10 м1Ч

ЭДТА, 300 мМ ацетата натрия с рН 6,0 и 0,54 объема изопропанола. ДНК повторно суспендируют и дополнительно 30 расщепляют эндонуклеазой BamHI. После экстракции ДНК смесью фенол/хлороформ и осаждения из этанола два указанных ограничительных фрагмента отделяют в 1,27-нам агарозном геле в трис-борат-ЭДТЛ буфере, рН 8,3. Из геля выделяют 0,6 т.п.о. фрагмент.

ДЕК элюируют и дополнительно очищают

ДЕ5? ионообменной хроматографией и осаждением этанолом. BamHI-HgaI

ДНК-фрагмент размером 0,6 т.п.о. повторно суспендируют в Н О при концентрации 40 мкг/мл.

Выделение pJDB207 дрожжевого векторного фрагмента. 9 мкг плазмиды 45 р.П1В207 РН05-TPA(12-2) расщепляют эндонуклеазой ВатНХ, ДНК экстрагируют смесью фенол/хлороформ и осаждают этанолом, суспендируют в 50 MM трисНСХ; рН 8,0, при концентрации

0,1 мг/MJI и расщепляют 7 ед. щелочной фосфатазы кишечника теленка в течение 1 ч при 37О(;. Фосфатазу инактивировали н течение 1,5 ч при 65 С.

ДИК очищают ДЕ52 ионообменной хроматографией и осаждением этанолом.

Крупный фрагмент ВапЛП размером

6,8 т.п.о, отделяют в 1,27, — ном агарозном геле в трис-(dopaò-ЭДТА буфере при рН 8,3. ДНК элюируют и очищают с помощью ДЕ52 ионообменной хроматографии и осаждением этанолом.

ДНК растворяют в воде в концентрации 0,4 мг/мл (0,1 пмоль/MKJI), 11игатирование РН05 промоторного фрагмента и десульфатогирудинового структурного гена с pJDB207. Дрожжевой вектор pJDB207, РН05-примотор-: ный фрагмент с РН05-сигнальной последовательностью и десульфатогирудиновый структурнь|й ген выделяют в виде фрагментов ДНК и лигируют их с образованием экспрессионной плазмиды.

В течение 20 ч при 15 С в 10 мкл смеси, состоящей из 60 мМ трис-НС1, рН 7,5, 1О мМ МрС12, 5 мМ ДТТ, 1 мМ

ATP и 400 ед.Т4 ДНК-лигазы, проводят лигирование 0,3 пмоль 0,6 т.п ° о, ВаНУ-НоаХ фрагмента р31/PH05-ÒÐÀ18 и

0,3 ймоль 0,2 т.п.о. HoaI-BaHI фрагмента pN13101. с 0,1 пмоль 6 8 т и о.

BamHI фрагмента pJDB207P/РН05-ТРА(122).

Аликвоту лигазной смеси объемом

1 мкл добавляют к 100 мкл трансформационных компетентных клеток Е,coli

HBI0l Клетки высевают íà LB-агаровые пластины, содержащие 50 мкг/мл ампициллина.

Apm колонии в количестве 24 ед, индивидуально выращивают в LB-среде в присутствии 100 мкг/мл ампициллина, Плазмидную ДНК анализируют с целью определения размера и ориентации вставки путем расщепления ограничительной эндонуклеазой Pstl. Клон с правильной ориентацией вставки обозначают как pJDB207/PH05-HIR.

Получение плазмиды рЛОВ207/PH05/ (Fco)-HIR, С целью удобного соединения элементов УА8(РН05)-GAPDH гибридного промотора с кодирующим участком десульфатогирудина, включающим

РН05-сигнальную последовательность (как и в плазмиде pJDB207/РН05-HIR) EcoKI ограничительный участок ввоI дят в 5 нетранслированную область между исходными участками RHK u ATG кодирующей области.

15 мкл плазмиды pJDB207/РНО-HRI расщепляют эндонуклеазой ПтаХ. Полученные в результате четыре фрагмента отделяют в 0,8%-ном агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере при рН 8,3, С геля регенерируют фрагмент ДНК раз- мером 4,2 т.п.о., подвергают элюиро13

16306)6

14 ванию и осаждают этанолом. ДНК повторно суспендируют в H 0 концентраЪ цией 0,6 мг/мл, Каждый из двух синтетических олигонуклеотидов, отвечающих формулам 5 -ААТТССАТТАССААТСТТТ-3 и

3 -GCTAATGGTTACAAA 5 .,(2,3 мкг и

2,9 мкг соответственнс1), подверга- !О ют действию киназы в 20 мкл смеси, состоящей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мИ MBC1Q, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ ATP u

20 ед.Т4 полинуклеотидокиназы. Через

45 мин при 37 С обе реакционные смеси объединяют, нагревают в течение

10 мин при 75 С и охлаждают до комнатной температуры. Отожженную олигонуклеотидную связку хранят при

-20 С. 20

Фрагмент размером 4,2 F.ï.o. DRAT.

ДНК в количестве 6,5 мкг (2,3 пмоль) инкубируют в течение 16 ч при !5 С в присутствии 70-кратного избытка киназированной и отожженной .олигонуклеотидной связки в 50 мкл смеси, состоящей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мМ

MgClg, 5 мМ ДТТ, 3,5 мМ ATP и 800 ед,Т<

800 ед.Ту ДНК-лигазы, После инактивации Т4. ДНК-лигазы в течение 10 мин при 85 С избыточные связки удаляют осаждением ДНК в присутствии 10 мМ

ЭДТА, 300 мМ ацетата натрия с рН 6,0 и 0,54 объема изопропанола, ДНК расщепляют эндонуклеазами EcoRI u 35

HindIII, Полученные в результате фрагменты отделяют в IX-ном агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере, рН 8,3, Фрагмент размером 643 элюи: руют и осаждают этанолом, повторно 40 суспендируют в концентрации

0,1 пмоль /мл, Фрагмент FcoRI-HindIII содержит РНО5 сигнальную последовательность, кодирующую последовательность десульфатогирудина и обрыва- 45 тель РН05 транскрипции.

Иэ плазмиды р31/К выделяли 534 п,о, РН05-промоторный фрагмент. !О мкг

p31/R расщепляют эндонуклеазами EcoRI и BamHI, Три фрагмента отделяют в 50

0 6Х-ном низкоплавком агарозном геле в трис"борат-ЭДТА буфере, рН 8,3, BamHI-EcoRI-фрагмент размером 534 п.о. содержит РН05 промотор, включающий исходные участки mRHK, 55

6 мкг плазмиды pJDB207/PH05-HIR расщепляют с помощью BamHI u HindIII

Крупный 6,5 т.п,о, фрагмент отделяют от других фрагментов в 0,67-ном .. агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере, рН 8,3, Три описанных фрагмента ДНК с соответствующими липкими концами лигируют ТУ ДНК-лигазой в соотношении

534 п.î. BamHI-FcoRI PH05-промоторного фрагмента 0,2 пмоль, 643 п.о.

EcoRI-HindIII-фрагмента (последова . тельность1 кодирующая гирудин )

0,2 пмоль, 6,5 т,п,о, BamHI-Н).ndIII векторного фрагмента 0,1 пмоль.

Аликвоту лигазной смеси в количестве 1 мкл добавляют в 100 мкл об работанных кальцием трансформационных компетентных клеток F..coli HBOI

Двенадцать трансформированных amp колоний индивидуально выращивают в

LB-среде, содержащей 10 мкг/мл ампициллина, Плазмидную ДНК анализируют с помощью EcoRI u BamHI ограничительного расщепления, Выделяют один клон с ожидаемыми ограничительными фрагментами и обозначают pJDB207/РН05 (Есо)-HIR.

IV. Лигатирование YASI (PH05)—

GAPDH гибридных промоторов с областью десульфатогирудина, кодирующей белок.

15 мкг плазмиды РЛЭВ207/ГНО5 (Есо)HIR расщепляют с помощью FcoRI u

HindIII. Фрагменты ДНК отделяют в

IX-ном агарозном геле в трис-боратЭДТА буфере, рН 8,3, Фрагмент 643 п.о. элюируют и осаждают этанолом, суспендируют в Н 0 в концентрации

0„1 riMoëü/ìêë. 6 мкг плазмиды рЛЛВ207/PH05-HIP исчерпывающе расщепляют эндонуклеазой HindIII u SalI.

Крупный 6,3 т,п.о. фрагмент (векторная часть) выделяют электрофорезом, экстрагируют фенолом, осаждают этанолом, суспендируют в 1- ф) в концентрации 0,05 пмоль/мкл..

10 мкл плазмиды pGAPDH-EI расщепляют с помощью BglII и FcoRI, Фрагмент 266 п,о, BglII-EcoRI отделяют на 1,2Х-ном агарозном геле в трис, борат-ЭДТА буфере, рН 8,3, элюируют, осаждают этанолом, суспендируют в

Н О в концентрации 0,3 пмоль/мкг.

0,3 пмоль 548 п.о. фрагмента SalIBglII, содержащего УАБ! (PH05)„

0,3 пмоль 266 п,о. BglII-EcoRI-фрагмента pGAPDHEI, 0,3 пмоль 643 п,о, EcoRI-HindIII-фрагмента pJDB207/РН05 (Есо)-HIR и б,12 пмоль 6,3 п.о. SalI15

1630616

HindIII-векторного фрагмента лигируют в 20 мкл смеси, состоящей из

60 мМ трис, рН 7,5, 10 мМ MgC1, 5 мМ

ДТТ, 1 мМ ATP и 400 ep„,Tg, ДНК-лигазы: в течение 6 ч при 15 С, Аликвоты лигазной смеси объемами 1 мкл и 3 мкл добавляют к 100 мкл обработанных кальцием клеток Е.coli НВ101, Выделение плазмиды из amp колойий и ограничительный анализ с помощью SalI, BgIII, EcoRI u HindIII проводят сог- . ласно описанному, Выбирают один положительный клон и ему присваивают обозначение pJDB207/PAPFI-HIR (YASI), Аналогичную конструкцию создают с помощью 201 п,о. BgIII-EcoRI-фрагмента, выделенного из pGAPDH-Р?. Одной выделенной плазмиде дают обозначение pJDB207/ÐÀÐÅI-HIR (YAS1), V, Лигирование YAS1 (PH05)-YAS2 (PH05)-GAPDH гибридных промоторов с протеин-кодирующей областью десульфатогирудина. Плазмиды рJDB?07/PAPEIHIR(YAS1) ) и рJDB207/PAPFI HIR(YAS1) 25 в количестве 3 мкг каждая расщепляют с помощью BglII. После экстракции феI иолом и осаждения этанолом 3 рецессивные окончания ДНК заполняют в реакции с Е.coli ДНК-полимеразой 1фраг- 30 мент Кленова), Энзим инактивируют в течение 10 мин при 70 С. ДНК допол0 нительно расщепляют с помощью SalI и 7,2 т.п,о, фрагменты выделяют электрофорезом на мягком агарозном геле, экстракцией фенолом и осаждением этаHoJIoM КаждьГГГ фрагмент повторно сус.пендируют в Н О в концентрации

0,05 пмоль/мкл. Такие фрагменты содержат гирудин-кодирующую область, 40 большинство векторных последовательностей и любой из двух различных

GAPDkI промоторных элементов, выде» ленных из рСАРЭН-EI или pGAPDH-FI, Плазмиду p31/Y расп епляют с помо- 45 щью BstEII инкубируют с помощью

Е.coli ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) согласно описанному и расщепляют с помощью SalI. Фрагмент

649 п..о. отделяют на мягком агарозном геле и регенерируют экстракцией фенолом и осаждением этанолом, 0,3 пмоль 649 п,о, фрагмента р31/У вкГГючающего YAS1-YAS2 (PH05) промоторный элемент и 0,15 пмоль каждо- 55

I o из 7, 2 T ° Г1 ° о . фраГ" MP.HTQB лигируют и трансформируют в клетки F,.col.i

НВ101, Плазмиды получают иэ amp коR.

Ф лоний и анализируют ограничительным расщеплением. Выбирают единичные колонии и их плазмидные ДНК обозначают как рЗРВ207/PAPEI-HIR(YAS1+YAS2) и рJDB207/PAPFI-HIR(YAS1+YAS2) °

Пример 5. 31 п.о. ДНК-последовательность является достаточной для выполнения функций фосфат-контролирующего элемента.

31 п.о. последовательность из верхней области РН05-промотора (положение от -381 до -351), ограниченная двумя боковыми делециями 10 и $13 (пример le), может потенциально содержать регуляторный сигнал. Это предположение может быть проверено путем синтеза двух комплементарных олигонуклеотидов, имеющих следующие структуры: 5 -AATTCGAAATATATATTAAATTAGCA

ССТТТТСССАС-3 и 3 -ССТТТАТАТАТААТТТ

AATCGTGCAAAA GCGTCTTAA-5

Эта последовательность содержит

31 п.о, последовательность к кото> рой примыкают EcoRI ограничительные участки, Такие участки EcoRI позволяют легко осуществлять полимеризацию последовательности с образованием мультимеров, а) Клонирование 31 п.о, элемента в вектор LT98. Каждый из двух синтетических олигонуклеотидов, взятых в количестве 50 пмоль, обрабатывают

?О ед, ТЧ полинуклеотидокиназы в

20 мл смеси, состоящей иэ 60 мМ трис, рН 7,5„ 10 мМ MgClg, 5 мМ ДТТ, 0 5 мМ АТР, Через 45 мин инкубации при 37 С обе реакционные смеси объединяют, нагревают в течение 10 мин при 75 С и охлаждают до комнатной температуры, Отожженные олигонуклеотиды хранят при -20 С. Киназированные и отожженные олигонуклеотиды в количестве ?,5 пмоль лигируют в течение

30 мин в объеме, равном,15 мкл. 3атем добавляют FcoRI-фрагмент LT98 векторной ДНК (0,075 пмоль) и; инкубируют в течение 6 ч. После трансформации клеток Е.coli HB101 плазмиды выделяют и анализируют путем расщепления с помощью BamHI, выбирают индивидуальные плазмиды с 1, 2, 3, 4 или

5 фрагментами FcoRI и проводят определение последовательности аминокис-лотных остатков (по методу Сангера),, ПоказанЬ> что культиплетные 31 п,о. элементы клонированы в ориентации от головы к хвосту, 8

17

1630616

Клетки трансформантов S.cerevisiae

CPF18 выращивают в 10 мл среды Difco без аминокислот, в которой добавле55 но 2% глюкозы и 20 мг/л L-гистидина, в 50 миллиметровой Эрленмейеровской колбе, при встряхивании в тече- б) Клонирование в р TDB207. Олигомеры 3! п.о, испытывают на их промотор-контролирующую функцию путем их встраивания вверх or Р элемента ОАРВН 5 промотора, Плазмиду р TDB207/PAPFIEGI(YAS1) укорачивают с получением плазмиды с вычеркнутым элементом

YAS1, Такую плазмиду расщепляют с помощью SalT и Bglll, очищают на геле и выделяют крупный векторный фрагмент. В независимой реакционной смеси эту же плазмиду расщепляют с поI мощью ВатпНЕ. Рецессивные 3 окончания заполняют ДНК-полимеразой Кленова, используя для этой цели все четыре НТФ. Участки с тупыми концами расширяют с помощью фосфорилированных Bglll-связок и после расщепления с помощью Sall u BglII путем 20 очистки на геле выделяют ДНК фрагмент, имеющий приблизительную длину

400 п.о. Крупный векторный фрагмент лигируют с Sall-Bglll фрагментом длиной около 400 п.о. с использованием

Т ДНК-лигазы. После трансформации

F..coli HB1 01 и выделения плазмиды получают плазмиду, не содержащую

PH05 YAS. Такую плазмиду обозначают как pJDB207/GAPFI-FGI. Эту плаэмиду расцепляют с помощью Bglll и она служит вектором для клонирования 31 п,о, олигомеров. 1 198, содержащую 1, 2, 3, 4 или 5-олигонуклеотидных вставок расщепляют с BamHI. Фрагменты различного размера выделяют очисткой в геле и независимо лигируют с

pJDB207/ GAPFI-EGl разрезанной эндо-! нуклеазой Bglll. Смесь расщепляют с

BglII для удаления нежелательного повторно лигированного вектора без

ДНК-вставки и затем используют для трансформации Е.coli HB101, Полученные плазмиды анализируют ограничительным анализом с помощью Sall и 45

Dral (участок внутри GAPDH промоторной части) .

Пример 6. Экспрессия полипептидов.

11!тамм CPF18 разновидности Saccharomyces cerevisiae трансформируют полученными плазмидами. ние 24 ч при 30 С до плотности

Зх1 О к:л./мл. Эти клетки промывают

О 9%-ным раствором МаС1 и используют для инокуляции 50 мл минимальной среды с низким Р, полученной согласно рецепту для среды Difco Jeast Nitrogen Base (без аминокислот, но содеркащей 0,03 г/л KHqP04, 1 г/л КС1 и

10 г/л L-аспарагина вместо (ИН4) чО

2% глюкозы и 1 г/л L-гистидина).

Культуры инокулируют до достижения плотности порядка 4xl О кл,/мл и перемешивают со скоростью 200 об,/мин в гечение 4? ч при ЗООС.

Дрожжи секретируют десульфатогирудиновые соединения в культураль-. ный бульон, После ферментации в течение 22 ч иэ культуральной среды отбирают образец объемом в 10 мл и его обогащают протеинами путем обессоливания и концентрирования на колонке, Колонку дважды промывают

1,5 мл системы вода — ацетонитрил (9:!) — 0,1% трифторуксусной кислоты. Десульфатогирудиновые соединения элюируют с колонки системой вода— ацетонитрил — 0,1% трифторуксусной кислоты (3:2 об,/об,). Элюат в количестве 2 мл концентрируют до конечного объема 400 мл, Десул;-.фатогирудин идентифигируют анализом с применением жидкостной хроматографии высокого давления, проводя сравнение с аутентичным десульфатогирудином и с помощью пробы на ингибирование тром- бина.

Полученные результаты представлены в табл.4.

Форлула изобретения

Способ получения десульфатогирудина, предусматривающий выделение и очистку целевого продукта, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, конструируют рекомбинантную плаэмидную ДНК, содержащую гибридный промотор PH05-GAPDH, состоящий из Clal-Sall РН05 промоторного фрагмента плаэмиды р31/У размером 545 Ьр, связанного линкером

BglIi с В@1ТЕ-EcoRI GAPDH промоторным фрагментом плазмиды рСАВН размером 266 Gbp, Sall-.Hindlll-фрагмент плазмиды рШВ207/РН05-HIP размером

6,3 kb, EcoRI-Hindlll-фрагмент плаз-: миды pJDB207/PH05(Fco)-HIR размером:

643 bp, кодирующий десульфатогиру20

1630616

Продолжение табл.1

2 дин, и HgaI-BamHI-фрагмент плазмиды ..

pML31OL размером 0,2 kb, трансформи( ру1от рекомбинантной плазмидной ДНК штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae GRF18, культивируют трансфор-., мированные клетки в жирной культуральной среде, содержащей 0,03 г/л: дигидрогенфосфата калия, Таблица1 10 !

-88

-57

-33

R

S лица 2

Таб

Положение последнего нуклеотида последовательности РН05, Клон

Таблица

"Левая" "Правая"

Делеция От

-До

Число нуклеотидов делеции А

В

С

К

Я

Н

К

М

0

А

В

С

Е

Я

Н

К

М

0

О

О

О

P

-502

-471

-422

-400

-392

-369

-350

-328

-300

-283

-255

-226

-211

-187

111 т(Тъ тс

S к(Ql

pl

Nl

М (L(L

1. к с!

Н

Нс

Gl

Fl 7

118 9

Д10

Д11

512

1((1 3 (1 4

Д15

Д16

517

Д18

Д19

Д20

Д21 д22

1 (23

524

Д25

526

А

В

С

Е

Ff

G1 . Н

Jl

К

I(Ml ь

0l

pl

R.2

Т

-501

-470

-421

-399

-391

-368

-349

-327 —.299

-282

-254

-225

-210

-186

-186

-186 ,-186

-110

-110

-110

-394

-394

-394

-383

-362

-347

-333

-307

-278

-263

-17,5

-175

-175

-175

-163

-125

-98

-98

-94

-90

-24

-35

-41

-48

-74

-89

-93

-97

-124

-162

-174

-26?

-277

-306

-332

-346

-361

-382

-393

108

77

28

17

22

17

21

22

51

36

12

24

62

89

13

17

22

Продолжение табл.3

1 630616

Правая" Делеция От До

"Лев

Число нуклеотидов делеции

Таблица 4

Плазмида

pJDB207/PAPEEHER (YAS1)

pJDB207/PAPFI"

HIR (YAS1)

pJDB207/PAPFIHIR (ТА$1+YAS2)

pJDB207/PAPEIHIR (YAS 1+ТАЯ 2) 2 0

30

2,8

Составитель Т,Забойкина

Техред M.Äèäûê „ Корректор С.1Пекмар

Редактор Н.Яцола

Заказ 445 Тираж 372 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и .открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 (Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина,!01

R

R

Е

Ю

С

В

А 27

Д28

Д29

11 30 б31

-87 -75

-56 -49

-56 -42

-56 -36

-32 -25

Десульфатогирудин (мг/л культурального бульона/ОД 6 ) 13

21