Способ сохранения in viтrо жизнеспособности растений

 

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в садоводстве при длительном хранении ценных сортов ягодных культур, преимущественно земляники. Целью изобрете ния является повышение длительности хранения растении в жизнеспособном состоянии без пересадки на свежие питательные среды и без внесения дополнительных доз свежего питательного раствора в первоначальную среду в период хранения. Способ состоит в том, что растения, полученные при микроклональном размножении, помещают в пробирки, закрытые ватными пробками ,, на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 1 - 4 мг/л маннита, и при соотношении в среде ионов аммония и нитратных ионов 1:(3+0,5), при этом пробирки запаивают в полиэтиленовую пленку. 6 табл. i КО

СОЮЗ СОВЕ ГСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ1630708 (Д1)5 А 01 Н 4/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСНОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ FIGHT СССР

1 (21) 4636303/13 (22) 24.11.88 (46) 28.02.91. Бюл. Ф 8 (71) Научно-исследовательский зональный институт садоводства нечерноземной полосы (72) О.Н.Самсонова и В.Г.Трушечкин (53) 578.085.23 (088.8) (56) Патент ГДР Р 213450, кл. С 12 И 5/00, 1984. (54) СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ IN VITRO . ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ РАСТЕНИЙ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в садоводстве при длительном хранении ценных сортов ягодных культур, преимуИзобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к садоводству, и может быть использовано для депонирования in ч1 го фитопатологически чистого, генетически однородного материала плодовых и ягодных растений, преимущественно земляники.

Цель изобретения — повышение длительности хранения растений в жизнеспособном состоянии и упрощение культивирования в период хранения.

Способ состоит в том, что дифференцированное растение, полученное при клональном микроразмножении меристдм, помещают в пробирку с модифицированной питательной средой, закрывают ватной пробкой и герметично . эапаивают в полиэтиленовую пленку, при этом питательная среда, содержа.

2 щественно земляники. Целью изобрете. ния является повышение длительности хранения растений г жизнеспособном состоянии без пересадки на свежие питательные среды и без внесения дополнительных доз свежего питательного раствора в первоначальную среду в период хранения. Способ состоит в том, что .растения, полученные при микроклональном размножении, помещают в пробирки, закрытые. ватными пробками, на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 1

4 мг/л маннита. и при соотношении в среде ионов аммония и нитратных ионов

1:(3+0,5), при этом пробирки запанвают в полиэтиленовую пленку. 6 табл. щая азотнокислый аммоний, азотнокис лый калий, азотнокислый кальций, ка-! лий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, железо сернокис,лое, трилон-Б, марганец сернокислый, 4 Р натрий молибденовокислый, борную кис- ® 3 лоту, цинк сернокисльп, калий иодис- " ©) тый, кобальт хлористьпЪ,-сернокислую (ф медь, маннит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, глицин, мезоинозит, сахарозу, агар-агар, воду бидистиллирован- ную, отличается тем, что соотношение ионов аммония к нитратным ионам, сос-, .тавляет 1:(3+0,5), а концентрация . маннйта от 1 до 4 мг/л, при следую, щем соотношении компонентов, мг/л:

Азотнокислый аммоний 1200-2000

Азотнокислый калий 1517-2528

Азотнокислый кальций 820-2461

1630708

10

50

Фосфорнокислый однозамещенный калий 169-171

Сернокислый магний 369-371 Сернокислое железо 55,6-55,8

Трилон-Б 74,4-74,6

Сернокислый марганец 22,2-22,4

Иолибденовокислый натрий 0,24-0,26

Ьорная кислота 6,1-6,3

Сернокислый цинк 8,5-8,7

Иодистый калий 0,82-0,84

Хлористый кобальт 0,024-0,026

Сернокислая медь 0,024-0,026

Ианнит 1,000-4,000

Тиамин 0,49-0,51, Пиридоксин 0,49-0,51

Никотиновая кислота 0,49-0 51

Аскорбиновая кислота 0,9-1,1

Глицин 1,9-2,1

Иеэоиноэитол 99-101

Сахароза 29000-31000, Агар-агар 6900-7100

Бидистиллированная вода До 1000 мл

РН (кислотная реакция) 5.,5-5,6

Пример 1. Способ основан на, использовании модифицированной пита- тельной среды, содержащей ионы аммо-, ния и нитратные ионы в следующем со-, отношении: NH . NOg = 1: (3+0,5) и маннит от 1 до 4 г/л, В табл. 1 приведены данные, харак; теризующие влияние различных соотно- шений ионов аммония к ионам нитрата на сохранение жизнеспособности растений земляники через различные от резки времени после посадки их на конкретную питательную среду.

Составы питательных сред приведены в табл. 2. !

Оптимальным вариантом питательной среды является среда, содержащая азотнокислого аммония 1201 мг/л; аэотнокислого калия 1517 мг/л; азот нокислого кальция 1641 мг/л, где выдерживается соотношение иона аммония к иону нитрата 1:3,3 (вариант 6 в табл. 1).

Пример 2. Способ основан на использовании питательной среды сос тава, приведенного в примере 1, при дополнительном введении в питательную среду 1 г/л маннита (вариант 2, табл. 2). Выбор оптимальной дозы маннита (достаточный минимум) основан на опытных данных, приведенных в табл. 3.

Пример 3. Способ осуществляют следующим образом, Дифференцированные растения, полученные размножением меристематических верхушек 111

vitro например земляники, помещают в пробирки с 10 мл модифицированной питательной среды, используемой в примере 2, затем пробирку закрывают стерильной ватой и дополнительно запаивают в полиэтиленовую пленку.

Именно сочетание ватных пробок и полиэтиленовых кассет позволяет на-. дежно предохранить растения в пробирках от иссушения и инфекции, а следовательно, и сохранить длительное время жизнеспособность растений.

Стерилизацию пробирок с питательной средой проводят в автоклаве при давлении 1 атм в течение 15 мин.

Все операции по пересадке растений проводят в асептических условиях в пылезащитной камере КП-5, которые создаются за счет непрерывного потока стерильного воздуха через камеру.

Ватные пробки и салфетки для пересадки растений автоклавируют при 2 атм в течение 1 ч. Инструменты для работы со,стерильным растительным материалом прокаливают в сушильном шкафу, предварительно завернув их в фольгу. Введение ме ристематических верхушек в культуру и их размножение проводят по общепри."няvoH методике.

1

Для исследования характера влияния, способа изоляции растений на длитель-, ность сохранения их жизнеспособности был поставлен опыт, результаты кото-: рого поэволяют сравнить данные предлагаемого способа с другими возможны-, ми вариантами изоляции (табл.4).

45 . Изобретение позволяет без исполь-;

1 зования биологически активных веществ и без специального оборудования добиться увеличения сроков хранения растений in vitro при комнатной температуре. (табл. 5-6).

Кроме того, использование.предла. гаемого способа сохранения in vitro жизнеспособности растений земляники исключает повторное инфицирование оздоровленных растений, как это бывает при обычных способах оздоровле ния растений и размножения уже оздо ровленных растений.

0708

1-4 мг/л при следующем со компонентов среды, мг/л:

Азотнокислый аммоний

Азотнокислый калий

Азотнокислый кальций

Фосфорнокислый однозамещенный калий

Сернокислый магний

Сернокислое железо

Трилон Б

Сернокислый марганец

Иолибденовокислый натрий

Борная кислота Сернокислый цинк

Иодистый калий . Хлористый кобальт

Сернокислая медь

Маннит

Тиамин . Пиридоксин r

Никотиновая кислота

Аскорбиновая кислота

Глицин

Иезоинозитол

Сахароза

Агар-агар

Бидистиллированная вода рН (кислотная реакция среды) 63 б р е т е н и я

Формула отношении и з о

1200-2000

1517-2528

820-2461

169-171

369-371

55,6-55,8

74,4-74,,6

22,2-22,4

0,24-0,26

6,1-6,3

8,5-8,7

0,82-0,84

0,024-0 026

0,024-0,026

1,000-4,000

0 49-0,51

0,49-0,51 0,49» 0,51, 0,9-1,1

1,9-2,1, 99" 101

29000-31000 6900-7100

До 1000 мп

5 5-5;6

Таблица 1

Ф

NH< Ю

Показатели

0:1

0:1

Вариант питательной среды, т. 2

ЯН1NOg, мг/л

КИОТ, мг/л

;, Са (ИОу ), мг/л

Живые растения, Ж

2 мес. хранения

5 мес. хранения

9 мес. хранения

1 5 . 6.

1650. 1601 1201

1900 2022 1517

1623 1641 1641

1201

2528

2461, 1900

1691

2104

79

42

45 15

42

0

Таблица 2

/ ) Вещество, мг/л

Варианты состава питательной среды

3 ) 4 5

6 7

Аммоний азотнокислый

Калий азотнокислый

1650

1650

1201 1201

1517. 2528

1601

1900

1900 2022.

1900,nocoG сохранения in vitro жизнеспособности растении, включающий по5 мещение растений в пробирки, закрытые ватными пробками, на питательную среду, содержащую азотнокислый аммоний, азотнокислый калий, азотнокислый кальций, фосйорнокислый однозамещенный калий, сернокислый магний, сернокислое железо, трилон-Б, сернокислый марганец, молибденовокислый натрий, борную кислоту, сернокислый цинк, иодистый калий, хлористый ко-. бальт, сернокислую медь, маннит, тиамин, пиридоксин, никотинову1о кислоту, аскорбиновую кислоту, глицин, мезои нозитол, сахарозу, агар-агар, бидис- 20 тиллированную воду, и последующее длительное выращивание на ней, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с це: лью повышения длительности хранения растений в жизнеспособном состоянии и упрощения культивирования в период хранения, пробирки с растениями дополнительно герметично запаивают в полиэтиленовую пленку, а соотношение ионов аммония к нитратным ионам в питательной среде устанавливают равным:1:(3+0,5) и концентрацию маннита

13 12 133 14

1630708

Продолжение табл.2 т Варианты состава питательной среды

1 2 3 4. 5 6 7,Вещество, иг/л

Кальций азотнокислый .

Магний сернокислый

Железо серно- кислое

Трилон-Б

Марганец сер-. нокислый

Калий фосфорнокислый однозамещен.

Натрий молибденовокислый

Борная кислота

Цинк сернокислый

Калий иодистый

Кабалы хлористый

Медь сернокислая 1аннит

Тиамин

Пиридоксин Никотиновая

1641 2461

371 371

2104 1691 1641

1623 1623

370 371

369

370

369

55,7 55,8

74,5 74,6

55,8 55,8

74,6 74,6

55,7

74,5

55,6

74,4

55,6

74,4

22,3 22,3 . 22,4

22,4 22,4

22,2

22,2

171

169

171

169

170 170

171

0,25

6,2

8,6

0 83

0,025

0,025

О

О 5

0,5

0,26

6,3

8,7

0,84

0,026.

0,026

О

0,51

0,51

0,25

6,2

8,6

0,83

0,025

0,025

0,5

0,5

О, 26

6,3

8,7.

0,84

0,026

0,026 .О

0,51

0,51

0,24

6,1

8 5

0,82

0,824

0,024

0,49.

0 49

0,24

6,1

8,5

0,82

0,024

0,024

О

0,49

0,40

0,26

6,3

8,7

0,8,4

0,026

0,026

О

0,51

0,51

0 51

05 0,5

О., 49

0,51

0,49 кислота

Аскорбиновая кислота

Глицин

Мезоинозитол

Сахароза

Агар-агаР;

Вода бидистил. лированная рН

БНф/Иоз

1,1

2,1

101

7100

0,9

1,9

99.

6900

0,9

1,9

99.

6900

1,0

2,О

7000

1,0

2,0

7000

1 1

2,1 101

7100

1,1

2,1

101

7100

До1л

5,5-5,6

1:3

До 1 л До 1 л До 1 л

5.,5;5,6 5,5-5,6 5,5-5,6

О:1 О:1 1:2

До1л

5,5-5,6

1:3

До 1 л До 1 л

5,5-5,6 5;5-.5,6

1:3,3 1:4 Срок хранения,мес

Маннит, г/л

2 3 4 5

100 100

60 100

40 80

100 100 1ОО 100

80 70 100 100

60 50, 80 40

П р и м е ч а н и е. Для указанного опыта используют питательную среду 1 (табл. 2).

Ф

Та бли ца 3

Влияние концентрации маннита в питательной среде на сохранение жизнеспособности растений в разные сроки хранения (Ж живых растений)

1630708

Таблица 4

Зависимость сохранения яиэнеспособности растений от способа изоляции внутренней среды пробирок прн различком сроке хранения (Х зивых растений) Способ изоляции стерильной внутренней среды пробирок

Срок хр неиня, мес анквя пленка+ эфольгае тонная пленка ьга Тонкая плени

+федь ата+

+фоль а льга олст емка

Вата

Фтоик пленк окка пленк

Вата+

+парафин

Фольга+ онкая вика

100 100

65. 90

60 80

4О 35

1ÎÎ 9О

90 75

75 68

55 47

1 о 5

95 95 100

80 50 100

63 45 81

37 40 . 50

100 100

59 . 90

53 75

35 70

90 90

5 . „g

Х няфекции на 8 мес О

О О

О 15

0 5

Й р н м в ч а н и е. В опыте используют среду из примера 2. Растения земляники на предлагаемой питательной среде в

1тробнрхах, закрытых ватными пробками и запаянных в полиэтиленовые, пакеты нэ толстой пленки (тол нина 120824 микрон) марки 10403020, сохранямтся до двух лет, причем выкивают нэ обцей массы около 5ОХ растеянй. Тонкая пленка, использованная в сравнительном опыте, назмвается термоусадоч» иой (голдина 0,4 0,5 микрон) и применяется для изоляции растений в склянМах со средой прн нх раэмнонении. 1

Таблица 5

Влияние сортовых особенностей

; на сохранение растениями земляники

: жизнеспособности при их хранении in

vitro íà питательной среде, не 25 содержащей маннит1,(7. живых растений}. 1

Та блица 6

Влияние сортовых особенностей на сохранение жизнеспособности растениями земляники при хранении их

in vitro на предлагаемой среде, содержащей маннит .,(Ж живых растений).

Время культивирования, мес

Сорт

Время культивирования, мес

Сорт

6 12

Гренада

Алая зорька

Зенга-Зенгана

35 Надежда

Золушка Зефир !

Составитель ВеДемкин,Редактор С.Лисина Техред ) ММоргентал Корректор H. yoK Заказ 505 Тираж 348 ° Подписное

1 ВНИИПИ Государственного комитета по изооретенигям и открытиям при ГКНТ СССР

113035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 ч

1Производственно-издательский комбинат "Патент", геУжгород, ул..Гагарина, 101

Зенит

Зенга-Зенгана

Надежда

Алая зорька

Редгонтлит

;Среднее

85 40

53 30

60 10

83 . 30

85 20 .. 73 26

12

64

36

13

28