Способ получения обратной транскриптазы из еsснеriснiа coli

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента, осуществляющего переписывание генетической информации с РНК в молекулы ДНК. Целью изобретения является повышение степени очистки обратной транскриптазы из Е coli. Получение обратной транскриптазы включает гомогенизацию клеток Е coli MRE-600, экстрагирование белка буферным раствором, фракционирование в двухфазной системе ПЭГ-декстран с последующей очисткой методами колоночной хроматографии на фосфоцеллюлозе, ДЭАЭ-целлюлозе, сефадексе G-100 и носителе Био-Рекс 70. Степень очистки 1358, удельная активность препарата 57000 ед/мг, выход по активности 2,8%, выход по белку 0,002%. 1 табл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 N 9/12

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

g " :;.гЯФЯ ,:,„,1е4ййй

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (53) 577.15.07 (088.8) (56) Патент США hh 4663290, кл. С 12 N 1/20, 1987. (21) 4632976/13 (22) 06.01.89 (46) 30.03.91. Бюл. hL 12 (71) Институт цитологии и генетики

СО АН СССР (72) Н.В.Воробьева, Л.Т.Небрат, И.О.Петрусева, А.Г.Ромащенко, А.Ф,Стариковская и МШШаманина

Ромащенко А.Г., Воробьева Н.В., Кожемякина Н.Н., Потапов В.А., Сидельникова

Н.П., Старообразова М.Г., Салганик P.È.

Р HK-зависимая, ДН К-полимераза

Езспег!сна coll. Доклады АН СССР, 1977, т. 233, с. 734-737.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента, осуществляющего переписывание генетической информации с PHK в молекулы ДНК.

Целью изобретения является повышение степени очистки обратной транскриптаэы из Е. coll.

Получение обратной транскриптазы включает гомогениэацию клеток Е. coll MRE

600, экстрагирование белка буферным раствором, фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран с последующей хроматографической очисткой, . включающей последовательную хроматографию на фосфоцеллюлозе, диэтиламиноэ„„„ «Ж„„1638162 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБ.РАТНОЙ

ТРАНСКРИПТАЗЫ ИЗ ESCHERICHIA COLI (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента, осуществляющего переписывание генетической информации с

PHK в молекулы ДНК. Целью изобретения является повышение степени очистки обратной транскриптазы из Е. coll. Получение обратной транскриптазы включает гомогенизацию клеток Е. coll MRE-600, экстрагирование белка буферным раствором, фракционирование в двухфазной системе

ПЭ Г-декстран с последующей очисткой методами колоночной хроматографии на фосфоцеллюлозе, ДЭАЭ-целлюлозе, сефадексе

G-100 и носителе Био-Рекс 70. Степень очистки 1358, удельная активность препарата

57000 ед/мг, выход по активности 2,8, выход по белку 0,002%. 1 табл, тилцеллюлозе. сефадексе G-100 и носителе

Био-Рекс 70.

Степень очистки и выход на каждой стадии приведены в таблице.

Способ иллюстрируется примерами.

Пример. Получение обратной транскриптазы из Е. coll.

1. Разрушение клеток бактерий и получение грубого экстракта.

К 1,5 кг биомассы MRE-600 ранней логарифмической фазы роста добавляют 750 мл водного раствора лизоцима с концентрацией

2 мг/мл. Суспензию титруют насыщенным раствором трис-(оксиметил)-аминомета на до рН 8,3, выдерживают 30 мин при 5 — TС, замораживают смесь жидким азотом и разрушают клетки в механическом гомогенизаторе при

1638162

3. Хроматография на фосфоцеллюлозе

P-11.

Полученный на предыдущей стадии белковый материал освобождают от полиэтиленгликоля, фрагментов нуклеиновых кислот, других низкомолекулярных примесей, а также избытка соли путем пропускания через колонку с сефадексом G-25 (грубым, Ч = 8 л), уравновешенную 50 мМ трис-HCI, рН 7,3, содержащим 50 мМ KCI, и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой P11 (V = 400 мл), уравновешенную буферным раствором того же состава. Разделение ведут в линейном градиенте KCI 0,05 — 0,5 М в

50 мМ трис-HCI, pH 7,3 (общий объем градиента 4 л). Фракции, содержащие активность обратной транскриптазы, объединяют и ведут осаждение белка диализом против насыщенного раствора сульфата аммония, рН Ф о р м у л а и з.о б р е т е н и я

7,5. Осадок белка собирают центрифугиро- Способ получения обратной транскрипванием (9000 об./мин, 45 мин).. тазы из Escherichia coil MRE-600, включаю8000 об./мин в течение 10 мин. К полученному порошку разрушенных клеток добавляют 3000 мл 0,05 M трис-HCI, рН 8,3, и с помощью механической мешалки ведут экстракцию в течение 1,5 мин, Экстракт осветляют центрифугированием (60 мин, 9000 об,/мин).

Выход белка на этой стадии составляет

72 г; удельная активность фермента

42 е.а./мг.

2. Фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран.

К 3300 мл полученного грубого экстракта добавляют 1095 мл 30 -ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ, мол,мас. 20000 D) и 200 мл 20 -ного раствора декстрана

Т-500. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин при помощи механической мешалки. Затем центрифугируют 40 мин при 9000 об./мин. Верхнюю фазу отбрасывают, а к нижней добавляют раствор, содержащий 0,4 М КС1, 50 мМ трис-HCI (рН 8,3) и

6 -ный раствор ПЭГ (мол,мас, 20000 D), из расчета 8 об. этого раствора на 1 об нижней фазы. После 30 мин энергичного перемешивания вновь разделяют фазы центрифугированием (40 мин, 9000 об./мин) и отбрасывают верхнюю фазу. К нижней фазе добавляют раствор, содержащий 4М КС! и

6 ПЭГ (мол.мас. 60000) в 50 мМ трис-HCI, рН 7,3, из расчета 3 об этого раствора на

1 об нижней фазы и перемешивают механической мешалкой 40 мин, Затем после 40 мин центрифугироваиия при 9000 об./мин декантируют верхнюю фазу и подвергают очистке содержащийся в нЕй материал.

Выход белка 12,7 r.; удельная активность 76 е.а./мг. Выход по активности 32 /.

Выход белка на этой стадии 120 мг удельная активность 2300 е.а./мг.

4. Хроматография на диэтиламиноэтилцеллюлозе ДЕ-52, Полученный на предыдущей стадии белковый материал обессоливают на колонке с сефадексом G-50 (средний V = 100 мл), уравновешенной 0,05 М трис-HCI, рН 7,3, содержащим 50 мМ KCI, и наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозой ДЕ-52 (V =

= 100 мл), уравновешенную буферным раствором того же состава. Хроматографическое разделение ведут в линейном градиенте КС! 0,05 — 0,5 М трис-HCI, рН 7,3, Суммарный объем градиента 1;0 л. Хроматографические фракции, содержащие белок с активностью обратной транскриптазы и не содержащие нуклеаз, объединяют, проводят осаждение белка диализом против суспензии сульфата аммония, как на стадии 3, и собирают белковый осадок центрифугированием.

Выход белка 8,7 мг: удельная активность — 12000 е.а./мг.

5, Гельфильтрация на сефадексе G-100, Осадок белка растворяют в объеме 1 — 2 мл 0,05 M трис-HCI, рН 7,3, содержащего

0,05 М KCI, раствор осветляют центрифугированием и наносят белковый материал на колонку с сефа де ксом G-100 (сверхтон кий, V = 100 мл, размеры колонки: диаметр 1 см, высота 70 см), Скорость нанесения и гельфильтрации 12 — 14 мл/ч. Элюент — 0,05 М трис-HCI. Фракции, содержащие белок с активностью обратной транскриптазы и не содержащие нуклеаз, объединяют и проводят следующую стадию очистки.

Выход белка на.этой стадии 6 мг; удельная активность 15000 е.а./мг.

6, Хроматография на Био-Рекс 70.

Белковый материал, полученный на предыдущей стадии, наносят на колонку (V = 2 мл) с Био-Рекс 70, уравновешенную

0,05 M трис-HCI, рН 7,3, содержащим

0,05 М KCI, со скоростью 4 мл/ч, Разделение ведут в линейном градиенте КО 0,050,5 М трис-HCI, рН 7,3 (суммарный объем градиента 20 мл) со скоростью 3 мл/ч; Фракции, содержащие обратную транскриптазу, объединяют, Выход белка 1,5 мг (концентрация около 0,5 мгlмл); удельная активность

57000 е.а./мг, Фермент хранится в виде замороженного раствора при -20 С без потери активности не менее одного года.

1638162

Составитель А,Семенов

Редактор Л.Веселовская Техред M.Mîðlåíòàë Корректор И.Эрдейи

Заказ 901 Тираж 365 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Ю щий разрушение клеток бактерий, экстрагирование белка буферным раствором, фракционирование со ступенчатым повышением концентрации соли в двухфазной системе полиэтиленгликоль — декстран и очистку методом колоночной хроматографии, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения степени очистки, фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль — декстран осуществляют со ступенчатым повышением концентрации KCf до 3 М, а очистку методом колоночной хроматографии выполняют последовательно на фосфоцеллюлозе P-И в линейном градиенте концентрации KCl от 0,05 до 0,5 M в буфере рН 7,3, 5 на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52 в линейном градиенте концентрации КС! от 0,05 до 0,5 M в буфере низкой ионной силы, рН 7,3, на сефадексе G-100 и на носителе Био-Рекс 70 в линейном градиенте концентрации КС! от

10 0,05 до 0,5 М в буфере низкой ионной силы, рН 7,3.