Штамм актиномицетов sтrертомyсеs rоснеi, осуществляющий полное разложение 2,4,6-трихлорфенола, или 2,4-дихлорфенола, или 2,6-дихлорфенола, или 2-хлорфенола

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки сточных вод и почвы от хлорированных фенолов Цель изобретения - получение нового штамма, обладающего способностью к разложению повышенных концентраций широкого спектра хлорированных фенолов Штамм Streptomyces rochel BKM Ac-1284D получен при выделении из смешанного образца почв хлопковых полей. Штамм полностью разлагает 2,4,6-трихлорфенол при концентрации его до 400 мг/л, а также 2,4- дихлорфенол, 2,6-дихлорфенол, 2-хлофенол при концентрации их в среде до 50 мг/л как в ростовых условиях, так и покоящимися отмытыми клетками.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 1/20. С 12 S 13/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ иы

l ни

К АВТОРСКОМУ СВ l4ETEЛЬСТВУ (21) 4696431/1.3 (22) 08.06,89 (46) 30.05.91. Бюл. М 20 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) Л.А.Головлева, О.Е.Заборина, Р.Н.Перцова и Л.И.Евтушенко (53) 663.15(088,8) (56) Steiert I.G. et al. Degradation of chlorinated

phenols by a pentachiorophenol degrading

bacterium. — Appl. Environ. Microbiol., 1987.

53, р.907-910. (54) ШТАММ АКТИНОМИЦЕТОВ STREPT0MYCES ROCHEI, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ

ПОЛНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ 2,4,6-ТРИХЛОРФЕНОЛА ИЛИ 2,4-ДИХЛОРФЕНОЛА, ИЛИ2,6ДИХЛОРФЕНОЛА, ИЛИ 2-ХЛОРФЕНОЛА

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки сточных вод и почвы от хлорированных фенолов.

Цель изобретения — получение нового штамма, обладающего способностью к разложению повышенных концентраций широкого спектра хлорированных фенолов.

Изобретение заключается в выделении штамма актиномицетов Streptomyces rochei

ВКМ Ас-1284D, деградирующего 2-хлор- или

2,4- или 2,6-дихлор, или 2,4,6-трихлорфенол, Штамм полностью разлагает 2-хлорфенол, 2,4-, 2,6-дихлорфенолы в концентрации 50 мг/л; 2,4,6-трихлорфенол (2,4,6-ТХФ) в концентрации 10 — 400 мг/л, используя их в качестве единственного источника углерода.

В процессе утилизации хлорфенолов в сре„„ Ж„„1б52335 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки сточных вод и почвы от хлорированных фенолов. Цель изобретения — получение нового штамма, обладающего способностью к разложению повышенных концентраций широкого спектра хлорированных фенолов.

Штамм Streptomyces rochei ВКМ Ас-1284D получен при выделении из смешанного образца почв хлопковых полей. Штамм полностью разлагает 2,4,6-трихлорфенол при концентрации его до 400 мг/л, а также 2,4дихлорфенол, 2,6-дихлорфенол, 2-хлофенол при концентрации их в среде до 50 мг/л как в ростовых условиях, так и покоящимися отмытыми клетками. ду выделяется стехиометрическое количество хлор-ионов. ° сей

Штамм Streptomyces rochel 303 выде- ( лен методом накопительной культуры из Ц1 смешанного образца почв хлопковых полей

Узбекской ССР, в течение 15 — 20лет обрабатываемых высокими дозами хлорароматических пестицидов, депони рован во

Всесоюзной коллекции микроорганизмов М под М Ас-1284D. для лолучения чистой культуры суслен- ) ь зию спор высевают на селективную среду, ъ отдельно стоящую колонию переносят на . полноценную агаризованную среду, покрытую мембранным фильтром (МИИроге, USA) с размером пор 0,12 мкм. Проросший через фильтр воздушный мицелий пересевают на селективную агаризованную среду и ис1652335 пользуют в качестве посевного материала в экспериментах.

Характеристика штамма.

Морфологические и культуральные признаки.

Спороносцы спиральные, поверхность спор гладкая. В клеточной стенке присутствует 0=диаминопимелиновая кислота. Дифференцирующие сахара не содержатся.

Гифы длинные, хорошо ветвящиеся. Споры округлые, 1-1,5 мкм в диаметре, Грамположителен, некислотоустойчив.

На овсяном и минеральном агаре воздушный мицелий серый, субстратный бесцветный, иногда бледно-розовый, растворимый пигмент не образуется. На органическом агаре воздушный мицелий белый или серо-белый, субстратный мицелий бесцветный или слабо-желтый, растворимый пигмент отсутствует. На органическом агаре с тироэином меланоидный пигмент не образуется. Диаметр колоний 2-8 мм. Имеет запах геосмина. Субстратный мицелий, как правило, не фрагментируется, Физиологические признаки.

Как источник углерода использует целлобиозу, фруктозу, инозит, сахарозу, галактозу, лактозу, мальтозу, маннит, L-рамнозу, ксилозу, инулин. Не утилиэирует раффиноэу, адонит, эритрит, 0-арабинозу. Как источник азота использует L-гистидин, гидроксипролин, слабо а -аминомасляную кислоту.

Гидролиэует пектин, лизитин, арбутин.

Образует НгЯ, обладает нитратредуктазной активностью. Растет на средах с 7

NaCl; 0,017ь йайз; 0,1 фенола при 45 С, Устойчив к неомицину в концентрации 50 мкг/мл, Чувствителен к рифампицину в концентрации 50 мкг/мл.

Не обладает антибиотической активностью в отношении Aspergillus niger, Bacillus

sabtllls, Streptomyces murlnus.

Раствт в диапазоне температур 10—

37 С, оптимум — 27 С.Аэроб.

Штамм не патогенен, Условия хранения: в лиофилизированном виде — в ампулах при 4 С и под жидким азотом — при 95 — 96 С. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 14 дней) на минеральной среде состава, г/л: Na2SO4 0,1; MgSO4 7HzO 0,8; KHgP04

0,7; (ИН4)2НРО4 1,5; 2,4,6-трихлорфенол 0,2; агар 15,0 (2,4,6-трихлорфенол добавляют в виде фенолята натрия).

Пример 1. Streptomyces rochei ВКМ

Âñ-1284D выращивают в течение 5 сут на косяках с минеральной агаризованной средой состава, г/л: NaS04 0,1; MgSO4 7HðÎ

0,8; КН2Р04 0,7; (NH4)zHPQ4 1,5, 2,4,6-ТХФ (в виде натриевой соли) 0,05; агар 15,0. Выросшую культуру вносят в жидкую среду аналогичного состава, разлитую по 100 мл в

5 медицинские колбы объемом 700 мл, 2,4,6ТХФ вносят в концентрации 10 мг/л, культивируют при 29 С в темноте на качалке при

180-200 об/мин.

2,4,6-ТХФ и продукты его метаболизма

10 экстрагируют из подкисленной до рН 2,0 культуральной жидкости эфиром. Качественный анализ осуществляют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках Silufоl UV-254. Пластины проявляют в

15 системе растворителей бензол:диоксан:уксусная кислота 90;10:2, Обнаружение производят в УФ-свете и опрыскиванием реагентом на хлорсодержащив вещества (0,1 г А9ЙОз, растворяют в смеси 1 мл дис20 тиллированной воды, 190 мл ацетона и 10 мл

2-феноксиэтанола, к раствору добавляют 1 каплю 30 -ной HzOz). После экспонирования в течение 15 мин в длинноволновом ультрафиолетовом свете хлорсодержащие

25 вещества проявляются в виде серых пятен на белом фоне. Соединения, имеющие фенольный гидроксил, обнаруживаются после опрыскивания диаэотированным бенэидином в виде желто-коричневых пятен. Про30 дукты метаболизма анализируют с помощью хромато-масс-спектрометрии на приборе LKB-2091 и в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия анализа в системе ВЭЖХ:

35 колонка LKB-2134 размером 4 х 250 мм, заполненная Spherisorb ODS-2 частицы 5

p m, растворитель — 70% метанола, 30 воды. скорость потока 0,7 мл/мин, УФ-детектор с переменной длиной волны LKB-2151.

40 Измерения проводят при длине волны 280 и

311 нм.

Количественйое определение 2,4,6ТХФ проводят спектрофотометрически по поглощению в ультрафиолетовом свете при

45 iL= 311 нм на приборе Specord M-40 (KarlZelss, lena, DDR), гаэохроматографически на хромографе модели 304 фирмы Руе

Unlcam (РМНрз) на колонке длиной 1,5 м, внутренним диаметром 2 мм с 7 ПЭГА и

37; НЗР04 ía Chromosorb W/AW 30/100

50 меш, температура ввода и колонки 150 С, детектора 160 С, газ-носитель азот, 30 мл/мин.

Концентрацию хлор-ионов в культуральной жидкости измеряют после отделе55 ния клеток центрифугированием. Анализ проводят с помощью хлор-селективного электрода Orlon 94-17 на ионоанализаторе

ion Analyzer ЕА940 (Ог1оп). Калибровку элек1652335

40

50 трода осуществляют по стандартам, приготовленным на среде для культивирования.

Культура способна к утилизации 2,4,6ТХФ в концентрации 10 мг/л. Время полного разложения 1 сут, В культуральной жидкости при этом обнаруживается стехиометрическое количество хлор-ионов, Пример 2. Процесс проводят аналогично примеру 1, но в среду для культивирования вносят 100 мг/л 2,4,6-ТХФ в виде натриевой соли. При этой концентрации

2,4,6-ТХФ исчезает полностью за 6 сут, в культуральной жидкости определяется при этом стехиометрическое количество хлорионов, оптическая плотность клеточной суспензии возрастает примерно в 5 раз от

0,012 до 0,067.

Пример 3, Процесс проводят аналогично примеру 1, но в среду для культивирования вносят 400 мг/л 2,4,6-ТХФ в виде натриевой соли. 2,4,6-ТХФ исчезает за 10 сут, в культуральной жидкости обнаруживается стехиометрическое количество хлорионов.

Пример 4. После выращивания исходного штамма на косяках с селективной средой (аналогично примеру 1} культуру вносят в жидкую среду состава, г/л; бактопептон

5,0; дрожжевой экстракт 3,0; глюкоза 5,0;

КгН Р04 0,2, разлитую по 100 мл в медицинские колбы объемом 700 мл, и выращивают в течение 20 ч при 28-30 С при перемешивании, Затем клетки отделяют центрифугированием и трижды отмывают 0.05 M фосфатным буфером, рН 7,0. Клетки вносят

B количестве 40 мг/Mil по сырому весу в колбы со 100 мл 0,05 М фосфатного буфера. рН 7,0. 2-Хлорфенол.добавляют в виде водного раствора натриевой соли до конечной концентрации 50 мг/л, Инкубируют при

29 С, в темноте на качалке при 180-200 об/мин. Через О. 6, 15, 18, 21, 24 ч отбирают пробы для анализа, Количественное определение хлорфенолов,минерального хлора и идентификацию метаболитов проводят методами, описанными в примере 1, Покоящиеся клетки Streptomyces rochei способны разлагать в течение суток 2-хлорфенол в концентрации 50 мг/л. При этом наблюдается выделение стехиометрического количества хлор-ионов, в качестве метаболита обнаруживается хлоргидрохинон.

Пример 5. Процесс проводят аналогично примеру 4, но в среду для инкубации вносят 2,4-дихлорфенол в виде натриевой соли до конечной концентрации 50 мг/л.

Покоящиеся клетки штамма разлагают 2,4ДХФ в течение 1 сут с выделением стехиометрического количества хлор-ионов, в качестве метаболита обнаруживается хлоргидрохинон, Пример 6. Процесс проводят аналогично примеру 4, но в среду для инкубирования вносят 2,6-дихлорфенол в виде натриевой соли для конечной концентрации

50 мг/л.

Покоящиеся клетки штамма разлагают

2,6-ДХФ в течение 1 сут с выделением стехиометрического количества хлор-ионов, в качестве метаболитов обнаруживается дихлоргидрохинон,хлоргидрохинон и хлорсодержащий продукт расщепления ароматического кольца с массой 133.

Пример 7. Процесс проводят аналогично примеру 4, но в среду для инкубирования вносят 2,4,6-дихлорфенол в виде натриевой соли до конечной концентрации

50 мг/л.

Покоящиеся клетки штамма разлагают

2,4,6-трихлорфенол в течение суток с выделением стехиометрического количества хлор-ионов, в качестве метаболитов обнаруживается дихлоргидрохинон, хлоргидрохинон и хлорсодержащий продукт расщепления ароматического кольца с массой 133.

Таким образом, штамм Streptomyces

rochei полностью разлагает 2-хлор-, 2,4-дихлор-, 2,6-дихлор-, 2,4,6-трихлофенолы. Разложен ие всех четырех изомеров сопровождается стехиометрическим выделением хлор-иона, Штамм усваивает более, широкий спектр хлорфенолов, разлагает их как в ростовых условиях, так и покоящимися отмытыми клетками, что имеет большое эначение, так как штамм может использоваться не только для очистки проМсТОКОВ, где возможна технология с иммобилизованными неразмножающимися клетками, но и для очистки мест локального загрязнения, где потребуется, чтобы штамм рос на этих субстратах.

Формула изобретения

Штамм актиномицетов Steptomyces

rochei ВКМ Ас-1284D, осуществляющий полное разложение 2,4,6-трихлорфенола или 2,4-дихлорфенола, ил и 2,6-ди хл о рфе н ол а, или 2-хлорфенола.