Штамм бактерий вrеviвастеriuм sp., осуществляющий полное разложение 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной или 2-метил-4- хлорфеноксиуксусной, или 2,4-дихлорфеноксиуксусной, или 2- хлорбензойной, или 4-хлорбензойной кислоты

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для микробиологической деградации хлорированных феноксиуксусных и бензойных кислот при очистке сточных вод и локально загрязненных участков. Цель изобретения - получение штамма, обладающего стабильной способностью к разложению расширенного спектра хлорароматических соединений. Штамм бактерий Brevibacterium sp. ВКМ В- 1731D получен при выделении из смешанного образца почв хлопковых полей. Штамм способен к полной утилизации в течение 60 ч 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной и в течение 48 ч 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислот в качестве единственного источника углерода и энергии при концентрации их до 200 мг/л, сохраняя эту способность в течение 130 генераций. Штамм также полностью разлагает за 5-7 сут 2-метил-4-хлорфеноксиуксусную, 2-хлорбензойную и 4-хлорбензойную кислоты в концентрации 20 мг/л. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 1/20, С 12 S 13/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4696430/13 (22) 08.06.89 (46) 30.03.91. Бюл, N 12 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) Л.А.Головлева и P.Н.Перцова (53) 663.15 (088.8) (56) Tiedje I,M. et al. 2,4-0 metabolism:

pathcorry of degradation of chlorocatechols

by Arthrobacter sp.— J. Agric. Food Chem„

1969, 17, 1021-1026.

Killbane 1.1. at. al. Biodegradation of 2,4,5Trichlorophenoxyacetic acid by à pure culture

of Pseudomonas cepacia.— Appl. Environ.

Microblol., 1982, 44, М 1, р. 72-78. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВРЕЧ!ВАСТЕЯ!ОМ

ЯР„ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ПОЛНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ 2,4,5-ТРИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ ИЛИ 2-МЕТИЛ-4-ХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ, ИЛИ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ, ИЛИ 2-ХЛОРБЕНЗОЙНОЙ, ИЛИ 4-ХЛОРБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для микробиологической деградации хлорированных феноксиуксусных и бензойных кислот при очистке сточных вод и локально загрязненных участков почвы.

Цель изобретения состоит в получении штамма, обладающего стабильной способностью к разложению расширенного спектра хлорароматических соединений, Поставленная цель достигается выделением штамма бактерий Brevibacterium

ЯХ,» 1638159 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для микробиологической деградации хлорированных феноксиуксусных и бензойных кислот при очистке сточных вод и локально загрязненных участков, Цель изобретения — получение штамма, обладающего стабильной способностью к разложению расширенного спектра хлорароматических соединений, Штамм бактерий Brevibacterium sp. ВКМ B. 1731D получен при выделении иэ смешанного образца почв хлопковых полей. Штамм способен к полной утилизации в течение

60 ч 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной и в течение 48 ч 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислот в качестве единственного источника углерода и энергии при концентрации их до

200 мг/л, сохраняя эту способность в течение 130 генераций. Штамм также полностью разлагает за 5-7 сут 2-метил.4-хлорфеноксиуксусную, 2-хлорбензойную и

4-хлорбензойную кислоты в концентрации

20 мг/л.

sp. В КМ В-17310, разл ага ю щего 2,4,5трихлорфеноксиуксусную (2,4,5-T), 2,4-дихлорфеноксиуксусную, или 2метил-4-хлорфеноксиуксусную, или 2хлорбенэойную, или 4-хлорбензойную кислоты. Штамм полностью разлагает перечисленные соединения, используя их в качестве единственного источника углерода и энергии, с выделением стехиометрического количества минерального хлора в среду.

Штамм выделен методом накопительных культур из смешанного образца почв хлопковых полей Узбекской ССР, в течение

1638159

35

15 — 20 лет обрабатываемых высокими дозами хлорароматических соединений,.

Чистая культура получена путем 15-ти кратного пересева одиночной колонии на минеральной агаризованной среде с 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода.

Характеристика штамма, Морфологические и культуральные признаки.

Штамм имеет цикл развития кокк-палочка-кокк. Культура в стационарной фазе роста состоит из кокков и коротких палочек с закругленными Концами, которые после перенесения в свежую среду растут, образуя неправильные палочки длиной 5,0-6,0 мкм и шириной 0,5 — 0,6 мкм, характерные для культуры в экспоненциальной фазе роста. Некоторые палочки изогнуты под углом.

Строение клеточной стенки характерно при грамположительных бактерий (по данным электронной микроскопии). На мясопептонном агаре, разбавленном в 10 раз, колонии слабожелтые с прозрачным краем и плотной серединой, края ровные, плоские, центр колонии выпуклый. На мясопептонном бульоне, разбавленном в 10 раз, рост в виде мути, пигментов в среду не выделяет.

На минеральной среде с цитратом колонии белые, плоские, с ровным краем, пигментов в среду не выделяет. На минеральной среде с глюкозой колонии белые, с ровным краем, плоские, шероховатые.

Физиологические"признаки, Аэроб, дает положительную катэлазную и отрицательную оксидазную реакции, оптимальная температура для роста 29 — 30 С.

Усваивает глюкозу и слабо образует на ней кислоту, усваивает цитрат, салицилат, п-оксибензоат, протокатехоат, гентизат, гомогенизат, лизин, глицин, серин, крахмал, целлюлозу не гидролиэует, желатину разжижает.

Хемотаксономические признаки, Аминокислоты клеточной стенки соответству1от мезо-диамино-пимелиновой кислоте с аланином и глутаминовой кислотой (молярное соотношение 1:3:2). Миколовые кислоты отсутствуют, В качестве основного менахинона обнаружен насыщенный менэхинон с изопреновыми единицами

M X-8(H4).

Условия хранения, Штамм Brevibacterlum sp. BKM В17310 хранится в лиофилизированном виде в ампулах при с 4 С и под жидким азотом при т, -(95 — 96) С. Штамм. может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 1014 дней) на минеральной соеде состава, г/л:

КН2РО4 0,1; (ИН4)гНРО4 2,0; Иа250 0,1;

Мц 504 0,3; КИОз 2,0; 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4;5-T) 0,3; агар 15,0.

2.4,5-T вносят в виде натриевой соли.

Пример 1, Штамм Brevibacterium sp.

ВКМ В-1731D выращивают в течение 24 ч на косяках с минеральной агэризованной средой состава, г/л; КН2РО4 0,1; (NH<)2HP04

2,0, Ка250 0,1; Мц$0д 0,3; ККОз 2,0; 2,4,5-Т

0,2; агар 15,0. .Выросшую культуру вносят в жидкую среду аналогичного состава, разлитую по

100 мл в медицинские колбы объемом 700 мл. Перед засевом в колбу вносят 2,4,5-Т (0,01 — 0,2 г/л) в виде водного раствора нэтриевой соли. 2,4,5-Т или продукты ее метаболизма экстрагируют из культуральной жидкости, подкисленной до рН 2,0 эфиром.

Качественный анализ осуществляют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol UV-254, (Kavalier, ЧССР).

Пластины проявляют в системе растворителей бензол;диоксан:уксусная кислота

90:10:0,2 (об/об). Обнаруживание проводят в УФ-свете и опрыскиванием реагентом на хлорсодержащие углеводороды (0,1 г АцКОз растворяют в смеси 1 мл дистиллированной воды, 190 мл ацетона и 10 мл 2-феноксиэтанола, к раствору добавляют 1 каплю 307ной НгОг. После экспонирования в течение

15 мин в длинноволновом УФ-свете хлорсодержащие вещества проявляются в виде серых пятен на белом фоне. Соединения, имеющие фенольный гидроксил, обнаруживаются в виде желто-коричневых пятен после опрыскивания диаэотированным бензидином.

Продукты метаболизма анализируют с помощью газовой хроматографии — массспектрометрии на приборе LKB-2091, Для анализа кислот пробы обрабатывают диазометаном, Газовую хроматографию осуществляют на стеклянной колонке 180 х 0,2 мм, фаза 1,5 / OV-101 (Merck) нэ носителе

СпготозогЫИ-HP (100-120 меш), температура испарителя 200 С, колонки 90 — 200 С, при скорости прогрева 5 град/мин, газ-носитель гелий, скорость 15 мл/Mèн. Условия масс-спектрометрического анализа: температура сепаратора и источника ионов 250 С, энергия электронов 70 ev. Ускоряющее напряжение 3,5 mb, ток ловушки 25,и А.

Количественное определение 2,4,5-T проводят в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), колонка размером 4 х 250 мм, заполненная

Spherisorb ODS-2 с размером частиц 5 мкм (LKB-2134), раствори-.ель — 45 g, метанола и

55 / воды, скорость. потока 0,7 мл/мин, детектор с переменной длиной волны (LKB

Variable Wavelength monitor 2151). 2,4,5-Т и

1638159 продукты ее метаболизма определяют измерением поглощения при 280 нм.

Концентрацию хлор-ионов в культуральной жидкости измеряют после центрифугирования клеток на ионоанализаторе

Jon Analyzer EA-940 (Orion) с помощью хлорселективного электрода (Orion) 94-17

Chloride electrode). Стандартные растворы готовят в среде для культивирования.

Культура способна к утилизации 2,4,5-Т (концентрация 10-400 мг/л) в качестве единственного источника углерода и энергии. В процессе роста штамма наблюдается лаг-фаза (24 ч), после которой происходит быстрая убыль 2,4,5-Т. Содержание 2,4,5-T при исходной концентрации 200 мг/л через

24 ч, по данным HPLC составляет 96 от исходного, через 48 ч — 35 / и через 60 ч

2,4,5-Т в среде не обнаруживается. В кул ьтуральной жидкости при этом определяется стехиометрическое количество хлор-ионов.

Численность клеток воз0оастает на 4 — 5 порядков с 2 10 до 6 10 — 2 10 кл/мл. В процессе разложения 2,4,5-T в качестве метаболитов обнаружены 2,4,5-трихлорфенол, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, 4хлорфеноксиуксусная кислота, дихлорокатехол.

Таким образом, полное разложение

2,4,5-Т культурой ВКМ-173D при концентрации 200 мг/л происходит за 60 ч.

Пример 2. Определение стабильности штамма.

Штамм Brevibacterium sp. ВКМ-17310 в экспоненциальной фазе роста высевают на полноценную питательную среду (МПА, разбавленный 10 раз), Через 48 ч отдельно стоящую произвольно выбранную колонию пересевают 3 раза каждые 24 ч на аналогичную полноценную среду. При среднем времени генерации 50 мин это составляет 86 генераций. Затем снова рассеивают до отдельных колоний на полноценной среде и проверяют способность 30 колоний к росту на агаризованной среде с 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и 6 колоний — к разложению 2,4,5-Т в жидкой среде, 100 колоний после 36 — 130 генераций сохраняют способность к деградации 2,4,5-T.

Полезное свойство (споссбность к разложению 2,4,5-Т) сохраняется у штамма

ВКМ-1731D в течение 5 мес хранения на агаризованной и в жидкой среде.

Пример 3. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в среду для инкубации вносят

2-метил-4-хлорфеноксиуксусную кислоту в виде натриевой соли до конечной концентрации 20 мг/л.

Штамм Brevibacterium sp. ВКМ-1731D в течение 5 сут разлагает ксенобиотик с выделением стехиометрического количества хлор-ионов, Пример 4, Процесс проводят аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в среду для инкубации вносят

2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в виде натриевой соли до конечной концентрации

200 мг/л.

Штамм разлагает гербицид полностью в течение 2 сут с выделением стехиометрического количества хлор-ионов.

Пример 5. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в среду для инкубации вносят

2-хлорбензойную кислоту в виде натриевой соли до конечной концентрации 20 мг/л, Штамм разлагает 2ХБ полностью в течение 7 сут с выделением стехиометрического количества хлор-ионов.

Пример 6. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1 зв исключением того, что в среду для инкубации вносят

4-хлорбензойную кислоту в виде натриевой соли до конечной концентрации 20 мг/л.

Штамм полностью разлагает 4ХБ втечение 5 сут с выделением стехиометрического количества хлор-ионов.

Таким образом, выделен активный штамм Вrevibacterium sp. ВKM-17310, который разлагает широкий спектр галогенированных соединений. Кроме 2,4,5-Т, он разлагает 2,4-дихлорфеноксиуксусную, 2метил-4-хлорфеноксиуксусную кислоты, а также хлорбензойные кислоты — 2-хлорбензойную и 4-хлорбензойную.

Деградирующая способность штамма стабильно сохраняется после многократных пересевов на полноценной среде, Формула изобретения

Штамм бактерий Brevibacterium sp, BKM В-1731D, осуществляющий полное разложение 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной, или 2-метил-4-хлорфеноксиуксусной, или

2,4-дихлорфеноксиуксусной, или 2-хлорбензойной, или 4-хлорбензойной кислоты.