Способ получения изолированных гепатоцитов

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии, экспериментальной и клинической медицине. Целью изобретения является повышение морфофункциональной сохранности гепатоцитов. Для этого печень перфузируют охлажденным до 4°С раствором Коллинза, затем при постоянной оксигенации раствором Хенкса в два этапа. На втором этапе в раствор Хенкса вводят 1 мМ ЭДТА. Дезагрегацию осуществляют в сахарозной среде, содержашей 2,5 мМ хлористого кальция. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12, N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4636314/13 (22) 12.01.89 (46) 30.06.91. Бюл. М 24 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР и Московский городской научно-исследовательский институт скорой помощи им, Н.В. Склифосовского (72) H.Ï, Суббота, И.М, Шиманко, А.M. Бело° ус, Л.Н. Зимина, В.С. Уманский и А.Н, Сукач (53) 578.085.23(088.8), (56) Авторское свидетельство СССР

М 1310426, кл. С 12 N 5/00, 1985 (публ.).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии, экспериментальной и химической медицине.

Целью изобретения является повышение морфо-функциональной сохранности гепатоцитов.

Пример 1. Для получения гепатоцитов используют печень, извлеченную из трупов людей, скоропостижно умерших от острой сердечно-сосудистой недостаточности со сроком ишемии не более 1,5-2,0 ч. Вес печени 1500-1700 r. Перфузию печени проводят следующим образом. Нижнюю полую и печеночные вены пересекают между двумя лигатурами, портальную вену канюлируют.

На начальном этапе нерециркуляторную перфуэию проводят безкальциевым, охлажденным до+4 С раствором Коллинза, объемом 5,0n под давлением 100-150 мм вод.ст., рН 7,4-7 5, в течение 10 мин. Затем проводят перфуэию 2,0 л раствора Хенкса без

„„5LI „„1б5947б А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАН-.

НЫХ ГЕПАТОЦИТОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии, экспериментальной и клинической медицине. Целью изобретения является повышение морфофункциональной сохранности гепатоцитов, Для этого печень перфузируют охлажденным до 4ОС раствором Коллинза, затем при постоянной оксигенации раствором Хенкса в два этапа. На втором этапе в раствор Хенкса вводят 1 мМ

ЭДТА. Дезагрегацию осуществляют в саха. розной среде, содержашей 2,5 мМ хлористого кальция. 3 табл, кальция при температуре перфузата в момент начала перфузии +37 С и постоянной оксигенации. После этого печень помещают в термостатированный раствор Хенкса и продолжают рециркуляторную перфузию этим же раствором, но с 1 мМ ЭДТА при постоянной оксигенации раствора в течение 30 мин. Скорость перфузии на всех этапах -250-300 мл/мин, После окончания перфузии печень освобождают от капсулы, измельчают на холоде (2 — 4 С) ножницами в охлажденной сахарозной среде следующего состава, MM: сахароза 250; KCI 5;

Na2HP04 0,4; КН2Р04 0,4; MgCI2 0,8 мМ;

ЭДТА 1; CaClz 2,5; НЕРЕЯ 10; альбумин 1, рН 7,5 — 7,4. Дезагрегацию осуществляют с помощью вибрации при частоте 50 Гц в течение 90 с. Полученную суспензию фильтруют через два слоя нейлона, после чего гепатоциты промывают 2-3 раза стандартным раствором Хенкса при центрифугировании 3 — 4 мин 1000 об/мин. Полученный осадок клеток в соотношении 1:10 заливают средой 199 во флаконы емкостью 250,0 мл и

500,0 мл и хранят в холодильнике при+4 С.

В 1,0 мл полученной взвеси содержится в среднем 2 10 клеток.

Морфологический контроль суспензии проводят электронно-микроскопически.

Электронно-микроскопический анализ изолированных гепатоцитов показывает хорошую сохранность плазматической мембраны, митохондрий наружной мембраны, эндоплазматического ретикулума с рибосомами и т.д.

Функциональную активность полученных гепатоцитов определяют по включению

С-гидролизата белков хлореллы.

Гепатоциты включают С-гидролизат белков хлореллы более интенсивно, чем по известному способу, что свидетельствует о сохранении белоксинтезирующей системы клеток на более высоком уровне.

Результаты белоксинтеэирующей активности гепатоцитов, fl 5-6,даны ниже, Одним иэ наиболее чувствительных тестов, позволяющих адекватно судить о сохранности полученных гепатоцитов, является определение мембранного потенциала, которое проводят с помощью потенциал-зависимого флуоресцирующего зонда-катиона ДСМ +/5/. Концентрирование зонда в клетках обусловлено трансмембранным потенциалом цитоплазматической и митохондриальной мембран. Снижение суммарной интенсивности флуоресценции зонда в клетках полученным известным способом свидетельствует о более выраженной деполяризации плаэматической мембраны, увеличении протонной проницаТаблица 1 емости клеток. Интенсивность флюоресценции ДМС+ в гепатоцитах, и 5-6, приведена в табл.2

Таким образом, заявляемый способ по5 эволяет получить гепатоциты с более высоким уровнем морфо-функциональной сохранности, чем прототип.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но с различными кон10 центрациями CaClz в среде дезагрегации.

Как видно из таблицы, добавка CaCIz в среду дезагрегации в концентрации 2,5 мМ позволяет получить гепатоциты, включающие "C-гидролизат белков хлореллы наибо15 лее интенсивно. Уровень флуоресценции

ДСМ свидетельствует о высоком мембранном потенциале.

Функциональные показатели гепатоци- тов, полученных с использованием в среде

20 дезагрегации CaClz в различных концентрациях, и 5 — 6, даны в табл.3

Таким образом, из проведенных экспериментов следует, что предлагаемый способ повышает марфо-функциональную сохран25 ность изолированных гепатоцитов.

Формула изобретения

Способ получения изолированных гепатоцитов, включающий перфуэию печени раствором Хенкса и последующую дезагре30 гациювсахароэной среде,отл ича ющийс я тем, что, с целью повышения морфофункциональной сохранности гепатоцитов, перфузию проводят в три этапа: вначале охлажденным раствором Коллинза, далее

35 раствором Хенкса, а затем раствором Хенкса с добавлением 1 мМ ЭДТА при постоянной оксигенации, а дезагрегацию проводят в присутствии хлористого кальция в количестве 2,5 мМ.

Таблица 2

1659476

Таблица 3

Составитель А.Маныкин

Редактор Я.Герасимова Техред М.Моргентал Корректор А.Осауленко

Заказ 1820 Тираж 381 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101