Способ культивирования респираторно-синцитиального вируса

 

Изобретение относится к вирусологии и культивированию клеток. Цель изобретения - повышение урожая респираторно-синцитиального вируса. Для этого при культивировании используется сыворотка крупного рогатого скота, предварительно обработанная ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 244 - 264 нм, мощностью излучателя 30 т в течение 30 - 60 мин, при этом сыворотку размещают на расстоянии 15 - 20 см от источника излучения и наливают слоем 0,8 - 1,0 см, после чего ее вносят в суспензию чувствительных клеток в синтетической питательной среде до конечной концентрации 5 - .10%. В клеточную суспензию также вносят стимулятор инфекционной активности вируса, в качестве которого используют смесь при следующем соотношении компонентов , об.ч.: диметилсульфоксид 1,2 - 3,2; 0,25%-ный раствор трипсина активностью 100 - 128 ЕД 0,8 - 2,8. При этом указанную смесь вносят в суспензию чувствительных клеток в синтетической питательной среде с сывороткой в соотношении 0,8 - 1,0: 100 за 1...2 часа до внесения вируса. fc

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 7/00, 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОЫУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

k (21) 4651255/13 (22) 14.02,89 (46) 15,06.91, БюлЛФ22 (71) Институт иммунологии (72) Э.А,Макарян и И.В,Красильников (53) 576.858 (088.8) (56) Нисевич Л.Л., Константинова Л,А., Стаханова В.М, Действие ДЭАЭ-декстрана и диметилсульфоксида на результат титрования вирусов парагриппа, респираторносинцитиального вируса и риновирусов в культуре клеток. — Вопросы вирусологии, М 3, с.344 — 347, 1972. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕСПИРАТОРР Н О-СИ Н ЦИТИАЛ Ь Н О ГО ВИРУСА (57) Изобретение относится к вирусологии и кульцввированию клеток. Цель изобретения — повышение урожая респираторно-синцитиального вируса. Для этого при культивировании используется сыворотка крупного

Изобретение относится к вирусологии и культивированию клеток.

Целью изобретения является повышение урожая респираторно-синцитиального вируса (P СВ).

Пример 1. Экспонирование сыворотки крупного рогатого скота (КРС) осуществляют в стерильных условиях (боксе) следующим образом: лампу марки БУФ-30 мощностью 30 Вт с длиной волны 254 нм размещают на расстоянии 20 см от поверхности сыворотки КРС, полученной обычным способом.

Сыворотку KPC наливают толщиной

0,8 см в стеклянную емкость плоским дном., . Ж„„1655983 А1 рогатого скота, предварительно обработанная ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 244 — 264 нм, мощностью излучателя

30 т в течение 30 — 60 мин, при этом сыворотку размещают на расстоянии 15 — 20 см от источника излучения и наливают слоем

0,8 — 1,0 см, после чего ее вносят в суспензию чувствительных клеток в синтетической питательной среде до конечной концентрации 5 — 10 (, В клеточную суспензию также вносят стимулятор инфекционной активности вируса, в качестве которого используют смесь при следующем соотношении компонентов, об,ч.: диметилсульфоксид 1,2 — 3,2;

0,25 -ный раствор трипсина активностью

100 — 128 ЕД 0,8 — 2,8. При этом указанную смесь вносят в суспенэию чувствительных клеток в синтетической питательной среде с сывороткой в соотношении 0,8 — 1,0: 100 за

1...2 часа до внесения вируса, и проводят ее обработку УФ-лучами в течеwe 30 мин при постоянном перемешивании, Клеточную массу (HeLa) для последующего культивирования вирусов выращивают в роллерной системе в условиях 37 С на роллерном аппарате. Средой для культивирования являлась культуральная среда 199, в которую вносят экспонированную УФ-облучением сыворотку KPC до конечной концентрации 5 . Посевная концентрация ткани (200 — 800),10 кл/мл в объеме 500 мл.

Скорость вращения аппарата составляет 12 об/мин. Длительность культивирования ткани составляет 5 сут. Пеоед

1655983 заражением клеточно-культурэльную среду разводят средой Игла в соотношении 1:1, а рН среды доводят до 7,8 — 8,0, После разведения клеточной культуральной среды вносят смесь ДМСΠ— трипсин 100 ЕД вЂ” 1:3 (в дальнейшем триптоксид или Т) в количестве 5 мл на 500 мл клеточно-культуральной среды и продолжают инкубацию ткани в течение 1 ч.

После обработки Т (через 1 ч) инокули. руют ткань одновременно дефростированной клеточно-культуральной среды, содержание СВ в титре 1:4096 — 1:25600 в соотношении 10 мл инокулянта на 100 мл клекточно-культуральной среды, Через 18 — 24 ч получают урожай вируса путем удаления клеточно-культурал ьной среды иэ инкубационных бутылей. Клеточный монослой со стенок стекла удаляют с помощью 0,25ф,-ного трипсина, подогретого до 37 С на роллере за 15 мин при скорости вращения 60 об/мин.

Полученный пул клеток вносят в клеточно-культуральную среду, титр PCB определяют только в клеточно-культуральной среде.

Определение титров PCB в клеточнокультуральной среде проводят классическим методом PCK. Результаты приведены в табл.1, Пример 2, Способ проводят аналогично примеру 1, однако используют сыворотку

КРС, размещая ее слоем толщиной 1 см в емкости на расстоянии 15 см от лампы УФ30. Время экспозиции 60 мин.

Экспонированную сыворотку KPC вносят в клеточно-культуральную среду в концентрации 10-,,ь. Обработку триптоксидом состава: 2,8 ч (70 мл) 0,25 -ного раствора трипсина 128 ЕД 1,2 ч (30 мл) ДМСО проводят за 2 ч до инокуляции вирусом при соотношении состав-ткань 0,8:100 — 4 мл состава на 500 мл клеточно-культуральной среды.

Результаты приведены в табл.2.

Пример 3, Способ проводят аналогично примеру 1, но используют УФ-экспонированную сыворотку KPC в течение 45 мин в концентрации 7ф, и триптоксид следующего состава: 3,2 ч. (80 (,) 0,25 -ного раствора трипсина, 0,8 ч (20 ) ДМСО в количестве 4,5. мл на 500 мл клеточно-культуральной среды, вносимый за 1,5 ч до заражения тканей.

B таблицах 1 — 3 представлены результаты по определениютитра PCB в клеточнокультуральной среде в 15 повторах.

Полученные результаты показывают неоспоримое преимущество Т, способного стимулировать инфекционную активность

PCB в 16 раз по сравнению с 0,25ф,-ным

55 раствором трипсина и в 64 раза по сравнению с ДМСО.

Таким образом, на основании полученных результатов по применению УФ-экспонированной сыворотки КРС и Т при культивировании РС-вируса имеет место не суммарный, а синергидный эффект, возникающий при смешивании 0,25 (-ного трипсина 100 — 128 ЕД с цельным ДМСО, Применение Т позволяет получать урожай PCB в 12,5 — 50 раэ больше по сравнению с контролем и в 800 раз по сравнению с интактными клетками.

Анализ полученных результатов показывает, что использование триптоксида позволило получить 3,1 — 25 раэ выше урожай по сравнению с контролем (0,25 -ный трипсин и ДМСО, взятые отдельно) и в 200 раз— по сравнению с интактными клетками.

Предлагаемый способ с использованием УФ-экспонированной сыворотки КРС и триптоксида позволяет получить урожай

PCB во много раз превышающий урожаи, полученные при использовании 0,25 -ного трипсина 100 — 128 ЕД и ДМСО, взятых в отдельности: в сравнении с контролем урожай PCB выше в 3,1 — 50 раз, в сравнении с интактными клетками — в 200 — 800 раз, при этом время культивирования сократилось с

5 — 8 сут до 2 — 4 сут.

Формула изобретения

Способ культивирования респираторно-синцитиального вируса, включающий получение суспензии чувствительных клеток в синтетической питающей среде с сывороткой, внесение в нее в качестве стимулятора инфекционной активности респираторно-син цитиального вируса диметилсульфоксида, последующую инкубацию полученной смеси и внесение в нее вируса, отличающийся тем, что, с целью повышенйя урожая вируса, в качестве сыворотки используют сыворотку крупного рогатого скота, обработанного ультрафиолетовыми лучами в течение 30—

60 мин, при этом сыворотку наливают слоем

0,8 — 1,0 см и размещают на расстоянии

15 — 20 см от источника излучения, а в качестве стимулятора инфекционной активности респираторно-синцитиального вируса дополнительно используют раствор трипсина активностью 100 — 128 ЕД при следующем соотношении компонентов, об,ч.: диметилсульфоксид 1,2 — 3,2; раствор трипсина активностью 100 — 128 ЕД 0,8—

2,8, при этом укаэанную смесь вносят в суспензию чувствительных клеток в синтетической питательной среде с сывороткой в соотношении (0,8 — 1,0):100 эа 1 — 2 ч до внесения вируса.

1655983

Таблица

Таблица2

Таблица 3

Составитель С. Светлышев

Редактор Т. Лазоренко Техред M.Ìîðãeíòàë Корректор О, Кундрик

Заказ 2030 Тираж 375 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101