Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к м - белку вируса гриппа типа а

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для разработки диагностических тест-систем. Цель изобретения - получение штамма гибридных клеток, продуцирующих типоспецифические моноклональные антитела к антигенной детерминанте М-белка вируса гриппа типа А, общей для разных подтипов Штамм получают при гибридизации клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных препаратом М-белка вируса гриппа ти па А (Ленинград) 385/80 Ri (H3N2) выделенным элекгрофоретически с помощью детергента дезинтегрона-0, с клетками миеломной линии 363-Ад8 653 Секретируемое гидридомой моноклональное антитело связывается с М-белком вируса гриппа типа А различных подтипов Штамм культивируется в стандартных уело виях для выращивания гибридом и легко переводится в асцитическую форму Продуктивность штамма 20 мкг/ил в культуральной жидкости и 5,8 мг/мл в асцитической жидкости. Штамм депонирован под № ВСКК (П) 354D СО с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е С К ИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4706646/13 (22) 19.06.89 (46) 30.05.91. Бюл. № 20 (71) Крымский медицинский институт

{72) tO.Ñ.Êðèâoøåèí, И.А.Попов, А.В,Червонский и Ю.Л.Криворутченко (53) 578.085.23(088.8) (56) Wyke К.Z. et а1. 1,Virology. 1984, ч.49, №

1, р.248 — 252. (54) ШТАММ ГИБРИ4НЫХ КУЛЬТИВИРУВМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L — ПРОДУЦЕНТ MOHOKЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К М-БЕЛКУ ВИРУСА

ГРИППА ТИПА А

{57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для разработки диагностических тест-систем.

Цель изобретения — получение штамма гибридных клеток, продуцирующих типоспециИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для разработки диагностических тест-систем.

Цель изобретения — получение штамма гибридных клеток, продуцирующих типоспецифические моноклональн ые антитела (Мон-АТ) в антигенной детерминанте M-белка вируса гриппа типа А, общей для разных подтипов.

Штамм получают следующим образом.

В качестве антигена используют субвирусные частицы, получаемые после электрофоретического удаления солюбилизированных с помощью детергента дезинтегрона-0 гликопротеинов вируса гриппа типа А (Ленинград) 385/80 R1 (H3N2) (производство Омутнинского химзавода).

Непосредственно после получения субви„„Я „„1652340 А1

IsIis С .2 N 5/18, С 12 P 21/08, А 61 К 39/395 фические моноклональные антитела к антигенной детерминанте M-белка вируса гриппа типа А, общей для разных подтипов.

Штамм получают при гибридизации клеток селезенки мышей ВА В/с, иммунизированных препаратом M-белка вируса гриппа типа А (Ленинград) 385/80 RI {H3N2), выделенным электрофоретически с помощью детергента дезинтегрона-0, с клетками миеломной линии 363-Ag8, 653. . Секретируемое гидридомой моноклояальное антитело связывается с M-белком вируса гриппа типа А различных подтипов.

Штамм культивируется в стандартных условиях для выращивания гибридом и легко переводится в асцитическую форму, Продуктивность штамма 20 мкг/ил s культуральной жидкости и 5,8 мгlмл в асцитической жидкости. Штамм депонирован под ¹ ВСКК (П) 354D. русные частицы втечение 30 сут инкубируют в присутствии дезинтегрона-0 при 4 С.

Мышам линии BALB/c внутрибрюшинно (в/бр) вводят препарат M-белка, содержащий 50 мкг белка, в забуференном фосфатами изотоническом растворе хлорида натрия (ЗФР) с полным адьювантом

Фрейнда, Иммунизацию повторяют с двухнедельным интервалом, но антиген вводят с

HenoJlkbIM адьювантом. Через три недели после второй иммунизации мышам вводят

100 мкг белка внутрибрюшинно внутривенно без адъюванта. Через 3 дня после этого

10 клеток селезенки иммунных животных гибридизуют с 3 х 10 клеток миеломы

Х63-Ag8, 653 с помощью 45 -ного раствора полиэтиленгликоля ПЭ Г-1000. После гибридизации клетки высевают в 96-луночные

1652340 планшеты по 10 на 1 лунку. В качестве

5 питательного. слоя используют перитональные мышиные макрофаги, которые высевают по10 на1лункуза1сутдослияния. Для культивирования и селекции гибридом используют минимальную среду Игла в модификации Дальбекко (ДМЭМ) с добавлением

15 -ной эмбриональной телячьей сыворотки; 10 М гипоксантина, 4 х 10 M аминоптерина и 1,6 х 10 M тимидина, Гибридому клонируют 3 раза методом конечных разведений, высевая на 1 клетке на лунку, содержащую 10 макрофагов. После третьего клонировайия около 96 полученных субклонов продуцируют Мон-АТ с М-белку вируса гриппа типа А (Ленинград) 385/80 Rt (H3N2), которые являются типоспецифичекими. Продукция иммуноглобулинов (ИГ) сохраняется на протяжении 21 пассажа In

vivo.

Полученный штамм гибридных клеток обозначают АМ-КРСК-2Д8.

Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН

СССР под номером ВСКК (П) 3530 и характеризуется следующими признаками:

Культуральные свойства.

Среда для культивирования — ДМЕМ или RPM1 1640 с добавлением 10 — 15 -ной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 ед/мл гентамицина; рН 7,6, температура 37 С, 5% углекислоты в атмосфере или без углекислоты. Посевная доза

10 кл/мл. Для выращивания. штамма используют стеклянную или пластиковую культуральную посуду. Во флакон объемом

25 см засевают 5 х 10 — 10 клеток штамма

5 . АМ-КРСК-2Д8 в 5 мл среды, пассаж 1 раз в

4 дня той же дозой клеток, без подсчетов клеток — 1:3-1:5. Через 3-4 дня концентрация антител в кул ьту рал ьной жидкости (КЖ) достигает 10-40 мкгl мл, Для выращивания опухоли из штамма используются мыши линии ВА В/с. Молодым мышам за 5 — 30 дней до введения клеток вводят в/бр 0,5 мл пристана. Клетки штамма инъецируют внутрибрюшинно по

5 х 10 на мышь в 0,5 — 1,0 мл среды 199.

Асцитическую жидкость (АЖ) собирают йо мере накопления (на 11 — 14 день). Процедуру забора АЖ проделывают многократно от живых мышей. Делают не менее трех взятий от каждого животного, Объем АЖ при взятии 4-5 мл. Концентрация антител (ИГ) и АЖ

4,2 — 15,3 мг/мл при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции.

Кариологическая характеристика.

Модальное число хромосом в клетках гибридомы 82 с областью варьирования 7686.

Продуктивность.

5 Стабильная секреция полезного продукта сохраняется до 30 пассажей In vitro c концентрацией 16 в КЖ до 20 MKf/Mfl и до 21 пассажа in vivo с концентрацией ИГ в АЖ до

5,8 мгlмл.

10 Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательной среде. Заражения микоплазмой не выявлено по окрашиванию

15 красителями на ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде, Криоконсервирование.

Клетки штамма ресуспендируют в культуральной бычьей сйворотке, содержащей

20 10 длиметилсульфоксида (концентрация клеток 5 х 10 — 10 в 1 мл), разливают в пла5 6 стиковые ампулы при 4 С, помещают в толстостенную коробку иэ полипеноуретана и переносят на 24 ч в холодильник (70 С). 3а25 тем клетки хранят в жидком азоте. Возможно программное замораживание со снижением температуры на 1 С в 1 мин до — 40 С с последующим переносом в жидкий азот. Размораживание осуществляют в

30 течение 3 мин при 37 С. Клетки разводят в

10 мл среды для культивирования, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в

5 мл той же среды и переносят в посуду для культивирования. Жизнеспособность кле35 .ток по включению трипанового синего составляет более 80 .

Характеристика полезного продукта.

Мон-AT, продуцируемое штаммом АМКРСК-2Д8, относится к IGy 1 подкласса и

40 взаимодействует с антигенной детерминантой М-белка вируса гриппа типа А, общей для различных подтипов, являясь типоспецифической. Взаимодействие антитела с различными штаммами вируса гриппа типа

45 А можно выявлять с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (И ФА) и иммуноблоттинга. В отличие от Мон-AT к гемагглютинину заявляемое вместе со штаммом Мон-АТ к М-белку не оказывает влия50 ние на гемагглютинацию, гемолиэ и,. инфекционность, связанные с вирусом

I гриппа.

Использование полезного продукта штамма АМ-КРСК-2Д8 иллюстрируется сле55 дующими примерами.

Пример 1. Полихлорвиниловые 96-луночные пластины покрывают вирусными материалами разных штаммов типа А в ЗФР в концентрации 1-10 мкгlмл по 50 мкл на 1 лунку. Спустя 8 ч лунки промывают в трех

1652340

10

25

35

55 сменах ЗФР с 0,05% твин-20 в течение 10 мин, В дальнейшем отмывают так же. Инкубируют на всех стадиях при комнатной температуре. Свободные валентности планшет насыщают в течение " ч 1 -ным раствором человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в ЗФР, после чего лунки отмывают и добавляют в них КЖ от заявляемой гибридомы по 50 мкл в 1 лунку на 1 ч. Далее лунки отмывают и инкубируют с кроличьей антисывороткой против IG мыши, разведенной

ЗФР в 100 раз, в течение 1 ч. Избыток антисыворотки отмывают и добавляют на 1 ч комплекспероксидаза-антипероксидаза (ПАП-реагент). flan-реагент получают, готовя смесь КЖ от гибридомы АР-РC-2В4, секретирующей Мон-АТ против пероксидазы хрена, с пероксидазой хрена (конечная концентрация в ПАП-реагенте 50 мкг/мл). Отмыв избыток ПАП-реагента, пероксидазную активность выявляют с помощью субстрата на основе ортофенилендиамина (ОРД): 5,1 . мл 0,2 М йагНРО4; 4,4 мл 0,1 М лимонной кислоты; 9,5 мл деионизованной воды;

0,04% ОРД.и 0,05 Н20 . С помощью концентрированной НзН04 рН доводят до 5;О.

Положительная реакция проявляется желто-коричневым окрашиванием лунок, Реакцию останавливают через 15 мин концентрированной Нг504 (по 5 мкл на 1 лунку со 100 мкл субстрата). Оптическую плотность оценивают при длине волны 492 нм с помощью прибора "Minireader" (0упасесп, США). Контрольные лунки вместо

Мон-Ат к M-белку обрабатывают КЖ от миеломы.

Используют также модификацию ИФА, когда вместо вирусных антигенов на полихлорвиниловые планшеты адсорбируют кроличьи моноспецифические антисыворотки против различных штаммов вируса гриппа и типа А, разведенные ЗФР в 100 раз. Спустя 8 ч их избыток отмывают, свободные валентности насыщают 1 -ным раствором

ЧСА в ЗФР, спустя 1 ч лунки отмывают и вносят, соответственно, вирусные материалы различных штаммов и другие реагенты в последовательности, аналогичной описанной, Пример 2. Вирусные материалы различных штаммов типа А подвергают электрофорезус ДСН по Лэммли, предварительно обрабатывая 2-меркапроэтанолом (2M3) и не обрабатывая их. Диск-электрофорез проводят в пластинчатых полиакриламидных гелях (ПААГ толщиной 1 мм с градиентом концентрации 5/30%. Фракционированию с помощью ДСН-ПААГ электрофореза подвергали как цельные вирусы, так и препараты очищенных гликопротеинов вирусов, полученные путем седимента,ционного отделения солюбилизированных дезинтеграном-0 гликопротеинов от вирусных коров. Кроме того, анализируют изолированный M-белок вируса гриппа, полученный методом хлороформ-метанольной экстракции, По завершении электрофореза белки из геля переносят на нитроцеллюлозную мембрану пассивной в трис-глицоновом буфере с 20 метанола (18 ч). Свободные валентности нитроцеллюлозы насыщают в течение 1 ч 1%-ным раствором ЧСА в ЗФР, после чего мембрану обрабатывают тестируемыми Мон-АТ 1 ч.

Отмывку на всех этапах проводят в трех сменах ЗФР с 0,05% твин-20 по 5 мин на шейкере при комнатной температуре. После отмывки мембрану обрабатывают кроличьей антисывороткой против IG мыши (разведение 1: i00) 1 ч при комнатной температуре, отмывают и обрабатывают ПАП-реагентом (см, пример 1) 1 ч. Отмыв избыток

ПАП-реагента, в опыт вносят субстрат;

0,05 тетрагидрохлорида диаминобенэидина; 0,01 Нг02 в 0,05 M трис-буфере с рН

7,6, на 5 мин при комнатной температуре.

Реакцию останавливают, погружая мембрану в дистиллированную воду. Мон-AT проявляют зону белка с молекулярной массой около 25 кДа как в вирусе, обрабатывавшемся 2МЗ, так и в вирусе, не проходившем такой обработки, что говорит о специфичности антител в М-белку, а не к легкой цепи гемагглютинина (ГА2). В материалах солюбилизированных гликопротеинов, очищенных от коров ультрацентрифугированием при 100000 g, проявляемый Ион-AT белок не выявляют. В то же время, изолированный с помощью кислого хлороформ-метанола M-белок вируса гриппа отчетливо реагирует с Мон-AT, Таким образом, штамм гибридных клеток AM-KPCK-2Д8 секретирует Мон-AT в антигенной детерминанте M-белка вируса гриппа типа А(Ленинград) 385/80 R1(HsN2), общей для группы исследованных штаммов вируса А различных подтипов.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК(П) М

354D — продуцент моноклональных антител к М-белку вируса гриппа типа А.