Способ определения сульфаниламидных препаратов в объектах биологического происхождения
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при проведении клинических, химико-токсикологических и судебно-химических исследований. С целью повышения точности исследования сульфаниламидные препараты изолируют из объектов биологического происхождения с помощью водного раствора кислоты. Полученное кислотное извлечение подвергают сорбционной очистке на микроколонках с полиамидным сорбентом от эндогенных веществ, способных образовывать азокрасители, а при проведении фотометрического исследования в качестве раствора сравнения используют смесь, полученную в результате смешения аликвотной части исследуемой очищенной вытяжки и всех реагентов, причем азокомпонент добавляется в реакционную смесь после приведения ее PH к значению в интервале 10,10 - 12,25 10%-ным раствором гидроксида натрия. 9 табл.
СОЮЗ СО8ЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 21/75
ГОсудАРственный кОмитет
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21).4669445/14 (22) 28.03,89 (46) 15.07.91. Бюл. N. 26 (71) Курский государственный медицинский институт (72) А.С.Квач, С.В.Плехов, И.В.Вишневский и M,В.Шевцова (53) 612.111.1 (088.8) (56) Тимофеева H.М. Фармакология и токсикология. 1944, т.7, %2, с.61-63. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФАНИЛАМИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ В ОБЪЕКТАХ
БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ .(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано при проведении клинических, химико-токсикологических и судебно-химических исследований. С целью
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при проведении клинических, химико-токсикологических и судебно-химических исследований.
Целью изобретения является повышение точности способа определения сульфаниламидных препаратов в объектах биологического происхождения.
Способ осуществляют следующим образом.
40 мл анализируемого кислотного, извлечения иэ ткани органа вносят в мерную колбу емкостью 50 мл, затем вносят в колбу
3,8 мл 40%-ного раствора едкого натра и доводят рН смеси до значения, указанного в табл.2 (графа 3). раствором 10 -ного гидроксида натрия, добавляя его по каплям, после чего уровень жидкости в колбе доводят до метки дистиллированной водой.
5 мл крови, исследуемой на содержание сульфаниламидного препарата, вносят в,, Я2, „1663516 А1 повышения точности исследования сульфаниламидные препараты изолируют из объектов биологического происхождения с помощью водного раствора кислоты. Полученное кислотное извлечение подвергают сорбционной очистке на микроколонках с полиамидным сорбентом от зндогенных веществ, способных образовывать азокрасители, а при проведении фотометрического исследования в качестве раствора сравнения используют смесь, полученную в результате смешения аликвотной части исследуемой очищенной вытяжки и всех ре/ агентов, причем азокомпонент добавляется в реакционную смесь после приведения ее рН к значению в интервале 10,10-12,25 10%ным раствором гидроксида натрия. 9 табл. центрифужную пробирку и прибавляют туда же 10 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают и через 5 мин в пробирку при перемешивании вносят 5 мл раствора
4н. хлорной кислоты, содержимое пробирки центрифугируют при 500д в течение 5 мин.
Центрифугат переносят в мерную колбу на
50 мл. Осадок в центрифужной пробирке еще дважды обрабатывают аналогичным способом раствором 1 н. хлорной кислоты порциями по 10 мл. К объединенным в мерной колбе емкостью 50 мл центрифугатам прибавляют 3,8 мл 40%-ного раствора едкого натра и после перемешивания доводят рН раствора до значения, укаэанного в табл.2 (графа 3), раствором 10% ного гидроксида натрия, добавляя его по каплям, после чего общий объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.
5 мл исследуемой мочи вносят в мерную колбу емкостью 50 мл и обьем жидкости в
1бб3516 колбе доводят до метки буферным раствором с соответствующим значением рН (табл,2, графа 3), В четыре подготовленные микроколонки с полиамидным сорбентом вносят одинаковые, точно отмеренные объемы подлежащей очистке биовытяжки (но не более, чем указано в табл,2, графа 4), обработанной по методике, описанной выше.
Микроколонки центрифугируют в течение
3-5 мин при центробежном ускорении 3005009, при котором скорость истечения ценрифугата в приемник составляет около 1 мл/мин. После центрифугирования приемники освобождают от центрифугата и приступают к промывке колонок буферными растворами с соответствующим значением рН (табл,2, графа 3), трижды внося их в микроколонки в объемах, указанных в табл.2 (графа 5). После внесения необходимых объемов буферных растворов проводят центрифугирование микроколонок в режиме, описанном выше. Полученные в приемниках центрифугаты отбрасывают, После проведения промывки микроколонок приступают к элюированию с них исследуемого сульфаниламидного препарата. С этой целью в микроколонки вносят буферный раствор с рН 11 в обьемах, указанных в табл,2 (графа 7), и трижды их центрифугируют. Полученные с четырех колонок элюаты собирают в мерную колбу емкостью 50 мл.
Общий объем жидкости в колбе доводят до метки дистиллированной водой. После перемешивания раствор используют для определения в нем содержания сульфаниламидных препаратов.
Для этого в четыре мерные колбы емкостью 25 мл вносят 0,05-10,0 мл полученного раствора, после чего к содержимому колб прибавляют по 1 мл 4 н. соляной кислоты и в первые три колбы по 1 мл 0,2 ного водного раствора нитрита натрия, После перемешивания в течение 15 с туда же добавляют по 1 мл 0,2 -ного спиртового раствора З-а, у-дикарбоксипропилроданина, После перемешивания в колбы поочередно добавляют 10 -ный раствор едкого натра в объеме, достаточном для получения при перемешивании отчетливого розовокрасного окрашивания (рН растворов должна находиться в пределах, указанных в табл.2), аналогичное количество 10%-ного раствора едкого натра вносят в четвертую колбу и после перемешивания туда добавляют 1 мл 0,2 -ного водного раствора нитрита натрия, 1 мл 0,2 -ного спиртового раствора 3-а, у-дикарбоксипропилроданина, После перемешивания в течение 15-20 с объем жидкости в колбах доводят дистиллированной водой до метки.
Определение оптической плотности окрашенных растворов азороданинов прово5 дятс помощью фотоколориметра КФК-2 при светофильтре с Аэфф. = 490+10 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 50 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный в четвертой мерной колбе.
10 Содержание сульфаниламидных препаратов в пробах рассчитывают по соответствующим калибровочным графикам, Для построения калибровочных графиков в мерные колбы емкостью 25 мл вносят
15 по 0,01, 0,05. 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 мл стандартного раствора препарата в 1,0 н. соляной кислоте с концентрацией 100 мкгlмл, недостающее до 1 мл количество 1 н. соляной кислоты и по 1 мл 0,1 -ного водного
20 раствора нитрита натрия. Через 15 с в колбы добавляют по 1 мл 0,1 -ного спиртового раствора 3 а "дикарбоксипропилроданина. После тщательного перемешивания общий объем жидкости в колбах доводят до
25 метки смесью- 0,05М растворатетрабората натрия и 0,1 н. раствора гидроксида натрия (1:2,95). После перемешивания содержимого колб производят измерение оптической плотности окрашенных раство30 ров азороданинов с использованием фотоколориметра КФК-2 в кювете с толщиной рабочего слоя 50 мм при светофильтре с длиной волны Eye = 490+10 нм.
Светопоглощение во всех случаях под35 чиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в пределах концентраций 1-40 мкг препарата в 25 мл конечного объема. В качестве раствора сравнения в данном случае используют смесь вышеперечисленных реактивов.
40 Количественное содержание сульфаниламидных препаратов в исследуемых образцах рассчитывают по следующим формулам: при определении содержания сульфаниламидных препаратов в тканях органов и
45 15,625 С Чоьщ
I где Х вЂ” содержание сульфаниламидного препарата (мкг) в навеске ткани органа, взятой на исследование;
50 С вЂ” количество(мкг) сульфаниламидного препарата, найденное по соответствующему калибровочному графику; Чмщ — общий объем (мл) кислотного извлечения, полученный из навески ткани органа;
VK — обьем исследуемого раствора (мл), нанесенный на одну микроколонку; /с — объем конечного раствора (мл), взятый на проведение одного анализа, 1663516
10
25
55 при определении содержания сульфа ниламидных препаратов в крови и моче
Х
\ где Х вЂ” содержание сульфаниламидного препарата в крови или моче (мкг/мл);
С вЂ” количество (мкг) сульфаниламидного препарата, найденное по соответствующему калибровочному графику;
V» — объем исследуемого раствора (мл), нанесенный на одну микроколонку, Чс — объем конечного раствора (мл), взятый на проведение одного анализа.
Подготовка микроколонок для работы, Очистку полученных вытяжек из тканей органов, крови и подготовленных к анализу проб мочи осуществляют методом сорбции на полиамидном сорбенте (ТУ 6-09-1-82273).
Микроколонка представляет собой трубку длиной 65-70 мм с внутренним диаметром около 13 мм. запаянную с одного конца перфорированной перегородкой. Для изготовления микроколонки на перфорированную перегородку кладут пористый диск из фильтровальной бумаги, после чего в колонку вносят необходимое количество (табл.2, графа 2) сухого сорбента и сверху помещают еще один пористый диск из фильтровал ьной бумаги. затем слой сорбента в микроколонке уплотняют поршнем от того же шприца, Поверх пористого диска из фильтровальной бумаги помещают прижимное кольцо с наружным диаметром 13 мм и внутренним диаметром 10 мм. Приемник представляет собой стеклянную пробирку длиной 45-55 мм с внутренним диаметром около 13 мм.
Хроматографическая микроколонка соединяется с приемником куском клейкой ленты размером 15х30 мм.
Перед работой микроколонку дважды центрифугируют с 96;ь-ным этиловым спиртом (порциями по 3-5 мл), после чего ее дважды промывают буферным раствором с необходимым значением рН (табл.2, графа
3) порциями по 3-5 мл, после такой подготовки микроколонка готова к работе. Для проведения анализа желательно готовить новую колонку. Бывшие в употреблении колонки можно использовать до трех рэз, подвергая их регенерации, для этого микроколонки трижды центрифугируют с порциями по 3-5 мл 96 -ного этилового спирта, после чего микроколонки дважды центрифугируют с порциями по 3-5 мл буферного раствора с необходимым значением рН (табл.2, графа 3). Хранить микроколонки можно в сухом виде, подготавливая перед работой по методике, описанной выше.
Пример 1. Определение содержания сульфаниламидных препаратов в ткани печени.
Свежую печень трупа человека, погибшего в результате травмы, мелко измельчают и по 100 r помещают в центрифужные стаканы емкостью 250 мл. В стаканы прибавляют по 40 мл раствора соответствующего сульфаниламидного препарата с концентрацией 100 мкг/мл в буферном растворе с рН 7,4 и оставляют на сутки при комнатной температуре, периодически перемешивая. Параллельно проводят холостые опыты. По истечении 24 ч в стаканы прибавляют 80 мл 1н. раствора хлорной кислоты. Содержимое стаканов тщательно перемешивают и центрифугируют при 5009 в течение 5 мин. Центрифугат сливают B химический стакан емкостью 1 л, а к твердому остатку в центрифужном стакане вновь прибавляют 80 мл 1 н. хлорной кислоты, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют в тех же условиях. Операцию изолирования проводят 6 раз. Общий объем объединенных вытяжек измеряют с помощью мерного цилиндра на 1 л. Около
50 мл полученного извлечения помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5009 в течение 10 мин. Из полученного безбелкового центрифугата отбирают 40 мл и далее поступают так, как описано выше.
Результаты определения содержания сульфаниламидных препаратов в ткани печени (модельная смесь) приведены в табл.4.
Как видно из табл.4, ошибка способа при определении содержания сульфэниламидных препаратов в ткани печени составляет 3,83-9,56 . Кевысокие результаты (73,13 ; 71,047;), полученные для некоторых препаратов, связаны не с недостатками предлагаемого способа определения, а с ограниченными возможностями способа изолирования сульфаниламидных препаратов растворами кислот из биологических тканей.
Для сравнения точности способов проведено определение содержания сульфэниламидных препаратов в контрольных опытах (т.е. в вытяжках из ткани печени, не затравленных сульфаниламидами)предлагаемым способом и способом, выбранным в качестве и рототипа (табл.5).
Из табл.5 следует, что предлагаемый способ позволяет точно определить содержание сульфаниламидных препаратов в кислотном извлечении из биологической ткани. Использование способа. предусматривающегс непосредственное определение
1663516
Таблица 1
Препарат
Концентрация в извлечении, мкг/100 мл
Способ определения
Норсульфазол
Стрептоцид
Этазол
200
Предлагаемый
Прототип
Предлагаемый
Прототип
Предлагаемый
Прототип
197 .272
3,3
43,3
11,0
45.0
1,5
36,0 сульфаниламидных препаратов в кислотной вытяжке по реакции образования эзокрасителя, не позволяет получить точных данных, что может привести к значительным ошибкам, особенно при судебно-химических исс- 5 ледованиях, так как даже в отсутствие в пробе исследуемых препаратов данные анализа свидетельствуют о их наличии в анализируемом образце. Предлагаемый способ позволяет полностью устранить зти недо- 10 статки, Пример 2. Определение сульфаниламидных препаратов в крови, В мерные колбы емкостью 100 мл прибавляютт по 10 мл раствора соответствующе- 15 го сульфаниламидного препарата в буферном растворе рН 7,4 с концентрацией
400 мкгlмл, после чего в колбы добавляют цитратную кровь человека, доводя уровень жидкости в колбах до метки, Содержимое 20 колб тщательно перемешивают и инкубируют в течение 24 ч. По истечении указанного срока отбирают пробы по 5 мл и далее поступают тэк, как описано выше.
Результаты определения содержания 25
-сульфэниламидных препаратов в крови представлены в табл,6.
Ошибка способа определения сульфаниламидных препаратов в крови составляет
0,69o -4,17, 30
Для сравнения точности предлагаемого способа и способа, выбранного в качестве .прототипа, было проведено определение сульфаниламидных препаратов в незатравленной крови. 35
Результаты исследования представлены в табл.7.
Пример 3, Определение сульфаниламидных препаратов в моче, В мерные колбы емкостью 100 мл при- 40 бэвляют по 10 мл раствора соответствующего сульфаниламидного препарата в буферном растворе с рН 7,4 с концентрацией 400 мкг/мл, после чего в колбу добавляют свежую мочу человека, доводя уровень 45 жидкости в колбах до метки. Содержимое колб тщательно перемешивают и инкубируют в течение 24 ч.
По истечении указанного срока отбирают пробы по 5 мл и далее поступают так, как описано выше.
Результаты определения сульфанилэмидных препаратов в моче человека представлены в табл.8.
Как следует из данных, приведенных в табл,8, ошибка способа определения составляет 2,18-4,12 .
Для сравнения точности предлагаемого способа и способа, выбранного в качестве прототипа, проведено определение содержания сульфаниламидных препаратов в образцах мочи, в которой отсутствовали определяемые препараты.
Результаты определения представлены в табл.9.
Данные, приведенные в табл.7 и 9, свидетельствуют о том, что использование способа, выбранного в качестве прототипа, не позволяет точно определять содержание сульфаниламидных препаратов в крови и моче, Использование предлагаемого способа позволяет полностью устранить зтот недостаток.
Результаты количественного определения сульфаниламидных препаратов в извлечениях из биологического материала
Как следует из данных, приведенных в табл.1, абсолютная ошибка способа, выбранного в качестве прототипа, может достигать
45, в то время как абсолютная ошибка предлагаемого способа не превышает 11 .
Формула изобретения
Способ определения сульфаниламидных препаратов в объектах биологического происхождения путем извлечения препарата из биообьекта кислотой, очистки, получения окрашенного раствора с азокрасителем и фотометрирования, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, вытяжку пропускают через колонку с полиамидным сорбентом, добавляют раствор гидроксида натрия до рН 10,1-12,85 и фотометрируют, используя в качестве раствора сравнения смесь, полученную в результате смешения аликвотной части исследуемой очищенной вытяжки всех реагентов.
Найдено препа- Абсолютная рата, мкг/100мл ошибка, 1663516
10 ф о
° !»
gj tlj а а ф
1 Е» х Ф
1 !
1 1
Й !
1! л ч оъ м л
o jjj v v l
o o o л л о о л л1 о ч е ь3 о
E & 1 k4 I ааОО Ej; I о аахеиаих хыообо j5ol
VjjE O л ееое о о л л л о л л л о д о ц
И
v e .а а о ж о о х 5
9 х э х ф
gg4
on 5
4 о а л а х а вой ъ ф о о
О 4 ф о
Ф
Ц л П!
К а о о ах
v o
Я 6l
Д О
leo о ц! !, — —
1
Х 1 I о
1 <М о!
ИХ EEE
О<О 1
„% И 3
nl а
1 о ф.а 1 м
Й
О сЧ
ЗУ
Ф о» вЂ” — 1 и м л л ч сч л а а а м а а а и м <и л е
I о х х а о х х х
13 Щ Х д д о m
Ц Ц !» c6 ю Р Э
u u z
1663516 .
Таблица 3
Интервалы значений рН, в пределах которых оптическая плотность азороданинов является максимальной и стабильной
Препарат
Интервал значений рН
10,90 — 12,25
10,10 — 11,30
10,80 — 11,60
Норсульфазол
Стр епто цид
Сульфален
Сульфамонометоксин
10,80 — 12,00
10,90 — 11 65
Этазол
Таблица
Определение содержания сульфаниламидных препаратов в извлечениях из ткани печени
Внесено
Р и/и
МорФологические характеристики препарата на 100 r ткани печени, мкг
Норсульфазол
Стрептоцид
3
1
3
4000
4000
Определено пре- парата в извлечении, мкг
3188
3059
2984, 2882
2956
3533
3251
3416
3432
Обнаружено препарата в извлечении, 7 к внесенному
79,70
76,48
74,60
72,05
73,90
88,33
81, 28
80,50
85,40
85 80
Х = 75,35
С = 2,90
Сх = 1,30
Х, = 3,61
А = 4,79
N = 75,35+ 4,79
Й = 84,26
G - =3,29
Gz = 1,47
I q = 4,08
А= 4,84
М = 84,26 4,08
1663516
1 (2
Продолжение табл,4
) 5
Сульфален
Сульфамонометоксин
Этаэол
Т а б л и ц а 5
Определение содержания сульфаниламидных препаратов в контрольных опытах предлагаемым способом
Внесено препарата на 100 г ткани печеНайдено препа- Найдено спората в вытяж- собом, выбранным ке, мкг в качестве прототипа п/п ни мкг
2
4000
4000
4000
3821
3824
3967
3958
3896
2829
2749
3136
2782
2847
2672
2743
1 0,00
2 0,00
3 0,00
4 0,00
5 0,00
95, 50
95,70
99, t7
98,95
97,40
70,73
68,73
78,40
78, 25
69, 55
71,18
75,25
66,80
73,38
68,58
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
97,37
С =- 3,00
Gx = 1,34
То4 =- 3, 74
А = й3,83
М = 97,34 + 3,74
Х =- 73,13
G = 5,63
GR =- ?,52
?рщ = 6,99
A =- 9,56
11 = 73,13+ 6,99
Х =- 71,04
Г = 3,44
Сх =- 1,54
>ag- =- 4, 28
А = 6,02
M = 71,03 + 4,28
976,17
828, 13
614,87
718,72
990, 12
1663516
15
Таблица 6
Определение содержания сульфаниламидных препаратов в крови человека
N Внесено прела- Найдено прела Найдено препап/п рата на 100 мл рата, мкг рата, 7. крови, мкг
Метрологические характеристики
Норсульфазол
Стрептоцид
Сульфален
Сульфамонометоксин
Зтаэол
1 4000
2 4000
3 4000
4 4000
5 4000
1 4000
2 4000
3 4000
4 4000
5 4000
2 4000
3 4000
4 4000
5 4000
1 4000
2 4000
3 4000
4 4000
5 4000
4000.
2 4000
3 4000
4 4000
5 400О. 3671
3671
3858
3763
3858
3954
3763
3763
3954
4000
3933
3823
3713
3823
3643
3908
3643
3643
91,78
89,38
91,78
96,45
94,08
96,45
98,85
94,08
94,08
98,85
100,00
99,00
100,00
99,00
100,00
98, 33
95,58
90,00
92,83
95,58
91, 08
95,50
97,70
91,08
91,08
Х = 92,69
С = 2,68
Сх = i 20
Т, 3, 33
А = 3,59
М = 92,69» 3,33
X = 96,46
G = 2,39
Сх =- 1,07
Iî,R5
А= 3,08
М = 96,46 « 2,97
Х = 99,60
G = 0,55
Сх = 0 25
I>qq = 0,69
Л = 0,69
И = 99,60» +0,69
Х = 94,46
G= 3,16
Сх = 1,41
I,,„ = 3,91
А= 4,14
М = 94,46 + 3,91
Х = 93,29
G = 3,12
Gx =- 1,40
Ig,ц = 3,89
А= 4,17
М = 93,29» 3,89
1663516
Таблица 7
Определение содержания сульфаниламидных препаратов в незатравленной крови (в контрольных опытах) Найдено способом, выбранным в качестве прототипа, мкг/мл
Найдено препарата предлагаемым способом, мкг/мл
У п/п
1 0,00 0,00
2 0,00 0,00
3 0,00 0,00
4 0,00 0,00
5 0,00 0,00
Таблица 8
Определение содержания сульфаниламидных препаратов в моче человека
Ф п/и
Найдено препарата, мкг
Найдено препа рата, 7
Метрологические характеристики
Н орсульфа з ол
Сульфален
Сульфамонометоксин
90, 00
87,25
90,00
90,00
92,83
Внесено препаратов на
100 мл крови, мкг
Внесено препарата на
100 мл мочи, мкг
1 4000
2 4000
3 4000
4 4000
5 4000
1 4000
2 4000
3 4000
4 4000
5 4000
1 4000
2 4000
3 4000
4 4000
5 4000
1 4000
2 4000
3 4000
4 4000
5 4000
3858
3763
3762
3671
3763
Стрептоцид
3763
3671
3?63
3954
3954
3980
3713
6,23
2,28
4,53
7,35
3,98
96,45
94,08
94,08
91,77
94, 08
94, 08
91,78
94,08
98,85
98,85
100,00
100,000
100,00
98,00
99,50
Х =- 94,09
Г =- 1,65
Гх = 074
А= 2,18
M = 94,08 2,05
Х=9553
G= 3,17
Сх = 1,42
Тд - = 3,94
А= 4,12
М = 95,53 3,94
Х = 99,50
С = 1,33
Gx = 0,77
Хцр = 2,11
А= 2,13
M = 99,50 2,11
Х = 90,02
Г = 1,96
Gx = 0,88
Io,,ч =- 2,44
А =- 2,71
И = 90,02 2,44
1663516
19
Продолжение табл. 8
1 (2 t 3
Этаэол
Таблица 9
° .
Определение содержания сульфаниламидных препаратов в незатравленйой моче (в.контрольном опыте) Составитель В. Миташин
Редактор А. Лежнина Техред М.Моргентал Корректор В. Гирняк, Заказ 2262 Тираж 411 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101
1 4000
2 4000
3 4000
4 4000
5 4000
3733
3733
3643
3643
93,33
95,50
93,33
91,06
91,06
Х = 92,86
С =- 1,85
СЬ 0,83
r, - 2,30
А 2,48
М 92,85- " 2,30
