Способ получения @ - n - ацетилглюкозаминидазы bacillus suвтilis вкпм в-2471
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения очищенного бактериального ферментного препарата, β - N - ацетилглюкозаминидазы, который можно использовать при исследовании карбогидразной части гликолипидных и гликопротеиновых веществ, при лечении лизосомальных болезней, как эталон при диагностике раковых заболеваний. Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа получения бактериальной β - N - ацетилглюкозаминидазы. Способ заключается в осаждении биомассы BACILLUS SUBTILIS ВКПМ В - 2471 ацетоном в соотношении 1:1, отделении ее центрифугированием и суспендировании в буфере. Далее суспензию биомассы обрабатывают препаратом β - N - ацетилглюкозаминидазы до перевода экзо - β -N - ацетилглюкозаминидазы в растворимое состояние, потом гелем фосфата кальция, для образования которого вносят 8 об.% хлористого кальция, затем фильтруют в присутствии 8 об.% фильтроперлита. Полученный фильтрат обессоливают диафильтрацией, фермент очищают хроматографией на депротеинизированном хитине, где сорбцию фермента проводят при рН 3,5 - 4,0, а элюцию - при рН 4 - 10. При использовании данного способа выход высокоочищенного препарата β - N - ацетилглюкозаминидазы повышается в 10 раз. К тому же упрощается способ выделения целевого продукта благодаря обработке биомассы ферментативным, химическим путем и аффинной хроматографии на хитине. При этом исключаются этапы центрифугирования, гельфильтрации и ионной хроматографии. 2табл.
СОК)Э СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4710366/13
1 (22) 26. )6.89 (46) 23.08.91. Бюл. 1,"- 31 (71) Всесоюзный научно — исследовательский институт прикладной энзимологии (72) В.Д.Паюодис, П.Д. Валанчюс и В.Б.Авиженис ,(53) 663. 13(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
Р 622282, кл . С 12 11 9/00, 1/20, 1976
0rtiz J.И. et al. Biochemica et
Biophysica Acta., 1972, v. 289,. р. 174 — 186. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-N-АЦЕТИЛГЛЫКОЗАЖШИДАЗЫ ВАСИЛА)Б 811ВТП?Б ВКПМ
В-2471 (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения очищенного бактериального ферментного препарата, 1з-М-ацетилглюкозаминидазы, который можно использовать при исследовании карбогидразной части гликолипидных и гликопротеиновых веществ, при лечении лизосомальных болезней, как эталон при диагностике раковых заболеваний. Цель изобретения — увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа получения бактериальной j3-N-ацетилглюкоИзобретение относится к биотехно.логии, в частности к технологии полу-. чения очишенного бактериального ферментного препарата Р -N — ацетилглюкозаминидазы, который можно использовать .при исследовании карбогидразной части гликолипидных и гликопротеиновых ве„„SU„„1671691 А I (51) 5 С 12 М 9/14//(С 1 N 9/14, С 12 Р 1: 1 l5) 2 заминидазы. Способ заключается в осаждении биомассы Вас 11из выЬ д1 з ВКПИ
В-2471 ацетоном в соотношении 1:1, отделении ее центрийугированием и сус— пендпровании в буфере. Далее суспензию биомассы обрабатывают препаратом р-"-"-ацетилглюкозаминидазы до перевода экзо-Р— N — ацетилглюкозаминидазы в растворимое состояние, потом гелем фосфата кальция, для образования которого вносяr 8 об.Е хлористого кальция, затем фильтруют в присутствии 8 об.Х фильтроперлита. Полученный фильтрат обессоливают диафильтрацией, фермент очищают хроматографией на депротеинизированном хитине, где сорбцию фермента проводят при рН 3 5 — 4,0, а элю- Ж цию — при рН 4 — 1Ч. При использовании данного способа выход высокоочищенного препарата Р -11-ацетилглюкозами- С нидазы повышается в 10 раз. К тому же упрощается способ выделсния лев левого продукта благодаря обработке биомассы ферментативным, химическим путем и афинной хроматографии на хитине. При этом исключаются этапы цент- у рифугирования, гель-фильтрации и ионной хроматографии. 2 з.п. ф-лы.
2 табл.
I ществ, при лечении лизосомальных бо— лезней, как эталон при диагностике раковых заболеваний.
Цель изобретения — увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа получения бактериальной /3 †N ацетилглюкозаминидазы.!
671691
Сll <«с об 3л к:11п  — 2471 (Π— 38) л««етоном в соотношении 1: 1, отде.«е«»111 < e 1«е««тр»фуг»рова»ием сусле нд««ровлни» в буфере . Суспензию биомассы обр;«блтывлют препаратом Р-Nа<цетилгл«<«кс<зл«<и«1 гдлэы до пере подл экэо $-N — лцет«ц«г «юкоэлминид",эы 13 растворимое состояш«е, потом гелем фосфа- 10 та кальция, д<пя образо«3лния которого вносят 8 об.7, х<«ористого кальция, фильтруют в присутствии 8 об. : <Ьильтроперлитл. Полученный <Ьильтрат обессоливают Л»лф»л«.трлцией, фермент очи- 1 щают хроматографией нл депротеиниэи<рова««ном хитине, где сорбцию фермента проводят пр«1 рП 3,5 — 4,0, л элюцию при рН 4 — 1«). П р и и е р 1 . .Препарат выделяют иэ культурлльной жидкости Bac.subti1is G-38. Берут 6300 см культуральной жидкости с активностью 56 мед/см» и осаждлют биомассу 63ОО см ацетона, охлажденного до 1 О С (соотношение 1: 1 )»5 Осадок отделяют центрифугированием при ЗООО об/мин. 1(ентрифугат отбрасывают. Полученную биомассу с активностью 3200 мед/г суспендируют в 500 см фосфатного буфера (рН 7,0), добавляют 3 г бактериальной -N àöåòèëãëþêosàìèíèдазы с активностью 10000 ед/г. Суспензию инкубируют в течение 2 ч при 20 С при перемешивании. Добавляют о 80 мл 50 .-ного рлствора хлористого кальция, потом наливают 270 см насыщенного раствора фосфорнокислого трехзамещенного натрия (рН смеси 7,1). В качестве фильтрующего агента добав — 40 ляют 8 об. . (40 г) фильтроперлита. Суспензию хорошо пере««е«икают и фйльтруют под вакуумом. Получают 600 см фильтрлтл с 3 -N-лцетилглюкозаминидазной акти«3»ость <1 329 мед/см . Выход 45 по активности 617. Влияние условий обработки препаратом -N-ацетилглюкозлминидазы на показатели процессов приведено в табл. 1. В примерах 1 — 5, реэупьтаты кото 50 ««ых приведены в тлбп. 1, изучается влияние об»глботки биомассы хлористым кальцием и присутствия перлита на фильтрацию и диаф««льтрацию. Иэ табл.1 видно, что обработка биомассы 8 об Л хл<»ристого клпьция и добавление 8 об. перлита дает лучшие результа— ты по ф««льтрлпии. Однако в диалиэированном <Ь«<пьтрате образуется осадок. В»рим<. .рлх 6 — 9 сус»< 1«э«ю б;«»масс, ; сначала обрабаты«<лют рлз«1«,м«1 ко:»«v<.— ст«3<3ми препарата -N-лцет«<пглюкоэаминицазы, а потом — ранее 1 одобранным оптимальным количеством х««ористого кальция и перлитл, затем подвергают фильтрации и диафнльтрации. Обработка биомассы препаратом P-N-ацетилглюкоэаминидаэы в количестве от 2 до 4 г оказывает существенное влияние на диафильтрацию. Диалиэированный фильтрат получают без осадка, а выход j3 -Nацетилглюкозаминидазы увеличивается в 2 раза. На основе исследований приняты следующие условия фильтрации: суспензию биомассы обрабатывают в течение 2 ч препаратом (3-N-аиетилглюкоэаминидазон в количестве 2 — 4 r добавляют 8 об. . хлористого кальция и насыщенным раствором фосфорнокислого трехзамещенного натрия доводят рН смеси до 7, 1, а потом вносят 8 об. перлита и проводят фильтрацию. Дпя обессоливания и подготовки фильтрата для хроматографии проводят диафильтрацию на проточной ультрафильтрационной установке, используя УАМ-150 мембраны. Процесс проводят следующим образом. В бачок заливают 600 см фильтрата, включают насос, создают на ультра— фильтрационном аппарате при помощи регулирующего вентиля давление О, 15 MIIa. Фильтрат циркулирует через ультрафильтрационную ячейку и возвращается в бачок, ультрафильтрат (жидкость, прошедшая через мембраны) собирается в отдельный сосуд. Сначала концентрируют исходный фильтрат до 320 см, потом концентрированный фильтрат разбавляют 0,00 1 M универсальным буфером (рН 4,0) до исходного объема и снова проводят диафильтрацию. По описанной схеме диафильтрацию ,проводят с шестикратным разбавлением 1 исходного фильтрата. Низкомолекулярные вещества и соли переходят в фильтрат, а биополимеры с мол.массой более 100 тыс. дальтон остаются в концентрате. В результате этой операции получают прозрачный диализированный раствор фермента объемом 84 см, активностью 1500 мед/см, со степенью очистки 544 раз, выходом 47 . 1671691 1. Способ получения )3 —;1-ацетилг (loâ 5 козаминидазы RAc111пз bt111з ВУ!11 В-2471, включаюupп отделение бпомас< ы центрифугированием, с успенд| рованпе ее в буфере, диаЬильтра|нпл и хромато— графическую очистку, о т л и ч а н шийся тем, что, с целью увеличс— ния выхода целевого продукта и упрощения способа, биомассу перед центрпфугированием осаждают ацетоном в co— отношении 1:1, суспензию биомассы об15 рабатывают препаратом (3 -N-ацетилглюко— заминидазы до перевода экзо — g-N — ацетилглюкозаминидазы в растворимое сос тояние,затем гелемфосфата кальция полученный растворфильтруют,а хроматографическую очистку проводят на депро3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что Фильтрацию ведут 30 в присутствии фильтроперлита в количестве 8 об.7. Г а б л и ц а 1 Пример Обработка суспензии биомассы ПродолжиПоказатели дпализа тель-N †Ацетилглюкоз1 аминидаза Количество СаС1, 7 для образования кальцийфосатного Количест- ность Оценка на осадок Выход по фильтрации, мин активности, 7 01 фильтво перлита, 7 Количе- Общая акство, r тивность, ед. рата геля Не Ьильтруется 420 Образует- 44 4 ся осадок То же 45,5 44,0 45,0 50 0 88,3 120 8 8 8.5 3 5 2 0000 Беэ осадка 86,4 87,4 120 40000 8 То же Вагружан т колонку с депротеинизированным хптпном н объеме 50 см и уравновешивают универсальным буфером 0,001 Г1 (рН 4,0) . (1а колонку наносят 84 см дидиализированного раствора фермента. Далее проводят элюцию фермента тем же универсальным буфером (0,001 М) в градиенте рН от 4 до 10. 1-N-Age xv глюкозами нида за элюируется в диапазоне рН 4,2 — 7,0. Фракции объединяют и получают 69 см элюата с удельной активностью 1225 мед/г белка, степенью очистки 2245 раз, выходом 247. Далее элюат лиофилизируют и получают 0,5 г препарата с удель— ной активностью 25 ед/мг белка. Характеристики основных этапов выделения высокоочищенного фермента 1--N-ацетилглюкоэаминидазы представлены в табл. 2. При использовании предлагаемого способа получения высокоочищенного препарата -Г1 — ацетилглюкозаминидазы повышается выход в 10 раз, а также упрощается способ выделения благодаря обработке биомассы ферментативным, химическим путем и афинной хроматографии на хитине. При этом исключаются этапы центрифугирования, гельфильтрации и ионной хроматографии. Ф о р м у л а и з; б р с т е- н и я теинизированном хитине 2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что для образования геля фосфата кальция использ уют 8 об . ь хлористого кальция . 1671691 Табди ita 0 ; ье t< cM Продукт; процесс Выхо 1, 7. Очистка, Удельная активность, мед/г.iбелка раз Кул -туральиая жидкость В. subtil is (:-38 6300 Оуспензпя биомассы 500 Фермент ат| видя t t химическая обработка биомассы и фильтрация 580 Диафильтрация 84 Хроматография tta хитине 69 Известный способ 40000 Выделение из В.впЬ 1— lis G-38 по схеме известного способа 1,0 51,0 100,0 91,0 6,3 320 134,0 543,6 2245,0 7000,0 55,6 35,8 24,0 2,1 843 1 500 23300 3225,0 20156 4,6 Составитель И.Чаплина Техред М.Дидык, Корректор С.Ыекмар Редактор И.Дербак Заказ 2803 Тираж 352 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производстве»но-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101
