Способ получения 11 -гидроксистероидов

 

Изобретение относится к синтезу стероидов, конкретно к способу получения 11β - гидроксистероидов путем микробиологического гидролиза 11β - ацилоксистероидов. Цель изобретения - интенсификация, ускорение процесса, а также расширение технологических возможностей способа за счет использования 11β - ацилоксистероидов, содержащих C₂-C₇ - ацильные остатки. Получение 11β - гидроксистероидов осуществляют путем микробиологического гидролиза 11β - ацилоксистероидов культурой Corynebacterium mediolanum (штамм ВКПМ В-964). Гидролиз проводят при 33°С и нагрузками субстрата 0,3 - 10 г/л в зависимости от его структуры, продолжительность гидролиза составляет 6 - 48 ч.

Изобретение относится к химии стероидов, в частности к способу получения 11β-гидроксистероидов из 11β-ацил- оксистероидов. Стероиды с 11β-гидрокси- группой являются высокоэффективными гормональными препаратами (будесонид, триамцинолон, ацетонид триамцинолона, преднизолон и др.) или полупродуктами их синтеза. Целью изобретения является упрощение, ускорение процесса, а также расширение технологических возможностей способа за счет использования 11β-ацилоксистероидов, содержащих С₂-С₇-ацильные остатки. Способ основан на применении культуры Corynebacterium mediolanum штамм ВКПМ В - 964, полученной известным путем в известных условиях, что показано при описании примера получения ее биомассы (пример 1). Под известными условиями имеются в виду условия хранения и выращивания культуры, внесения субстратов, трансформации и выделения продуктов реакции, состав питательных сред, температурный режим и т.д., используемые при получении кортексолона. В частности, выращивание культуры и трансформация проводятся при известной температуре работы культуры Corynebacterium mediolanum 28-37^oC, оптимально 33^оС. Гидролиз таких предшественников как 11β-ацетаты стероидов Corynebacterium mediolanum осуществляют при нагрузке субстрата 1,5-10 г/л в зависимости от его структуры; продолжительность гидролиза составляет 6-30 ч в зависимости от структуры и нагрузки субстрата при 33^оС. Так как культура сохраняет активность до 48 ч, нагрузка ряда соединений может быть увеличена. Гидрокортизон был получен из его 11,21-диацетата с практически количественным выходом при нагрузке 5 и 10 г/л и продолжительности гидролиза 6 и 10 ч соответственно. По сравнению с известным способом применение для гидролиза 11β-ацетатов С. mediolanum шт. ВКПМ В-964 позволяет увеличить нагрузку субстрата в 8 раз и сократить продолжительность гидролиза в 4 раза. Нагрузка субстрата и продолжительность гидролиза 11β-ацилатов с С > 2 составляет 0,3-5 г/л и 10-48 ч в зависимости от длины ацильного остатка. Способность С.mediolanum осуществлять гидролиз 11 β-ацетатов и 11β-ацилатов с С > 2 установлена впервые. П р и м е р 1. Подготовка культуры Corynebacterium mediolanum для гидролиза. Используют культуру С.mediolanum ВКПМ В-964. Рабочую культуру выращивают стерильно в течение двух пассажей по 3 ч при 33^оС в пробирках на скошенных столбиках плотной питательной среды PS следующего состава, г: пептон 4,5; дрожжевой экстракт 3; гидролизат казеина 4; мясопептонный бульон 150 мл; глюкоза 1, агар-агар 20; дистиллированная вода до 1 л, рН среды 6,9-7,0. Затем осуществляют в стерильных условиях накопление однородного по морфологическим характеристикам посевного материала в течение двух пассажей в конических колбах объемом 500 мл со 100 мл жидкой питательной среды СМ-6 следующего состава, г: дрожжевой автолизат 6; глюкоза 3; К₂НРО₄ 3Н₂О 2,5; Na₂HPO₄ x 12H₂O₄; NaCl ₂; дистиллированная вода до 1 л, рН среды 7,2-7,3. Рабочую культуру с поверхности плотной питательной среды PS смывают 5 мл физиологического раствора и по 0,5 мл полученной суспензии засевают среду в колбах, в которых выращивают первый пассаж культуры в течение 24 ч при 33^оС на круговой качалке (220 об/мин). Полученную культуральную жидкость в количестве 0,6% объемных используют для выращивания второго пассажа культуры в колбах со средой СМ-6 в аналогичных условиях. Выращивание трансформационной культуры осуществляют в колбах или лабораторном ферментере на среде ВК-4К следующего состава, г: кукурузный экстракт 8; Na₂HPO₄ ^.12H₂O 4,5; KH₂PO₄ 1; дистиллированная вода до 1 л, рН среды 7,0-7,1. В среду перед стерилизацией вносят в качестве индуктора 21-ацетат 3 β,21-дигидрокси-5-прегнен-20-она (МАR) или субстрат (0,05-0,1 г/л). Среду стерилизуют при 120^оС в течение 30 мин, затем охлаждают до 33^оС и стерильно вносят посевной материал, которым служит культура второго пассажа в количестве 7,5 об.%. Культивирование проводят при 33^оС в колбах на качалке (220 об/мин) или ферментере при перемешивании (500 об/мин) и аэрации (0,7 л/л мин). Через 16 ч роста накопление биомассы прекращается, рН увеличивается с 7,0 до 8,0-8,5. П р и м е р 2. Получение гидрокортизона (нагрузка 1,25 г/л). В 10 конических колб емкостью 500 мл со 100 мл культуральной жидкости с культурой С. mediolanum, полученной по примеру 1, вносят по 0,125 г (всего 1,25 г) тонкодисперсного (размер кристаллов < 40 мкм) 11,21-диацетата гидрокортизона в 1 мл воды (нагрузка 1,25 г/л). Ферментацию проводят при 33^оС на качалке (220 об/мин) в течение 6 ч. Контроль процесса на окончание гидролиза осуществляют методом ТСХ на пластинах Silufol" UV-254. По окончании гидролиза объединенную культуральную жидкость экстрагируют 3 х 1 л этилацетата, экстракт упаривают в вакууме до объема 200 мл, полученный раствор обрабатывают 0,125 г активированного угля, уголь отфильтровывают, промывают этилацетатом. Фильтрат упаривают в вакууме досуха, осадок сушат до постоянной массы. Получают 1,01 г (99,5%) гидрокортизона с т.пл. 200-205^оС, после перекристаллизации из метанола т.пл. 210-215^оС [α]_D²⁰+159^o (с 1, МеОН). ИК-спектр, см^-1: 3430, 1705, 1640, 1605. П р и м е р 3. Получение гидрокортизона (нагрузка 5 г/л). Опыт проводят аналогично примеру 2, но в 2 колбы загружают по 0,5 г (всего 1 г) 11,21-диацетата гидрокортизона. Нагрузка составляет 5 г/л. Получают 0,80 г (98,5%) гидрокортизона с т.пл. 200-205^оС и 210-215^оС (из МеОН), [α]_D²⁰ + 159^o (с 1,МеОН). П р и м е р 4. Получение гидрокортизона (нагрузка 10 г/л). Опыт проводят аналогично примеру 2, но в одну колбу загружают 1,0 г 11,21-диацетата гидрокортизона. Нагрузка составляет 10 г/л. Получают 0,70 г (86,2%) гидрокортизона с т.пл. 201-204^оС и 209-214^оС (из МеОН), [α]_D²⁰+159^o (с 1, МеОН). П р и м е р 5. Получение будесонида (нагрузка 7 г/л). В лабораторный ферментер емкостью 5 л с 3,4 л культуральной жидкости с культурой С.mediolanum, полученной по примеру 1, вносят 24 г тонкодисперсного (размер кристаллов < 40 мкм) 11,21β-диацетата будесонида в 40 мл воды (нагрузка 7 г/л). Ферментацию проводят при 33^оС при перемешивании (700 об/мин) и аэрации (0,2 л/л мин) в течение 6-7 ч. По окончании гидролиза культуральную жидкость экстрагируют 3х3 л этилацетата, экстракт упаривают в вакууме досуха, осадок сушат до постоянной массы. Получают 20,03 г (99,8%) будесонида с т.пл. 180-210^оС. После очистки из этилацетата с предварительной обработкой активированным углем получают 14,05 г (70,0%) фармакопейного будесонида с т.пл. 224-235^оС (Кофлер), [α] _D²⁰+101,8^o (с 0,28, СН₂Сl₂), соотношение эпимеров В (22R-) :A(22S-) =50:50. ИК-спектр, см^-1:3500, 1725, 1665, 1615, 1600. П р и м е р 6. Получение 16 α-гидроксипреднизолона (нагрузка 5 г/л). Опыт проводят аналогично примеру 5, но в 3 л культуральной жидкости загружают 15 г 11,21-диацетата 16 α-гидроксипреднизолона. Нагрузка составляет 5 г/л. Получают 9,66 г (78,7% ) 16 α-гидроксипреднизолона с т.пл. 202-207^оС (Кофлер), [α]_D²⁰+79,5^оС (с 1, МеОН). После очистки из ацетона получают 9,18 г (74,8%) 16α-гидроксипреднизолона, который используют для получения будесонида и десонида. Т.пл. 206-209^оС (Кофлер), [α]_D²⁰ + 71,2^o (c 1, МеОН). ИК-спектр, см^-1: 3470, 3410, 3200, 1700, 1650, 1610, 1590, 1100, 1060. П р и м е р 7. Получение 11,21-дигидрокси-9α-фтор-1,4,16-прегнатриен-3,20-ди- она (нагрузка 1,5 г/л). Опыт проводят аналогично примеру 5, но в 6 л культуральной жидкости загружают 9 г 11,21-диацетата 11 β, 21-дигидрокси-9α -фтор-1,4,16-прегнатриен-3,20-диона. Нагрузка составляет 1,5 г/л, продолжительность гидролиза 14 ч. Получают 7,26 г (99,5%) 11 β,21-дигидрокси-9α-фтор-1,4,16-прегнатриен-3,20-ди- она с т.пл. 245-250^о, который без очистки используют для дальнейших превращений. Аналитический образец получен путем перекристаллизации технического продукта из ацетона. Т.пл.247-250^оС, [α]_D²⁰+152^о (с 0,5, МеОН). ИК-спектр, см^-1: 3320, 1650, 1610, 1600, 1570. Масс-спектр: найдено МН⁺ 361, рассчитано М 360,4. П р и м е р 8. Получение десонида (нагрузка 5 г/л). Опыт проводят аналогично примеру 2, но в колбы загружают по 0,5 г (всего 1 г) 11,21-диацетата десонида. Нагрузка составляет 5 г/л, продолжительность гидролиза 30 ч. Получают 0,83 г (99,7%) десонида с т.пл. 245-250^оС, который без очистки используют для получения будесонида. После очистки из ацетона т.пл. 260-264^оС, [α]_D²⁰+120^o (с.1, МеОН). ИК-спектр, см^-1: 3490, 3360, 1705, 1665, 1610, 1590, 1085, 1050. П р и м е р 9. Получение преднизолона (нагрузка 5 г/л). Опыт проводят аналогично примеру 2, но в 2 колбы загружают по 0,5 г (всего 1 г) 11,17,21-триацетата преднизолона. Нагрузка составляет 5 г/л, продолжительность гидролиза 30 ч. Получают 0,74 г (99,9%) преднизолона с т.пл. 210-215^оС после перекристаллизации из ацетона, т.пл. 233-235^оС, [α]_D²⁰+102^o (с 1, диоксан). ИК-спектр, см^-1:3465, 3425, 3400, 1700, 1650, 1605, 1590. П р и м е р 10. Получение преднизолона из 11,21-дипропионата (нагрузка 5 г/л). Опыт проводят аналогично примеру 2, но в 2 колбы загружают по 0,5 г (всего 1 г) 11,21-дипропионата преднизолона. Нагрузка составляет 5 г/л, продолжительность гидролиза 24 ч. Получают 0,72 г (95,0%) преднизолона с т.пл. 210-215^оС, после перекристаллизации из ацетона т.пл. 232-234^оС, [α]_D²⁰+102^о (с 1, диоксан). П р и м е р 11. Получение преднизолона из 11,21-дикапроната преднизолона из 11,21-дикапроната преднизолона (нагрузка 0,3 г/л). Ферментацию проводят аналогично примеру 5, но в 3 л культуральной жидкости загружают 0,9 г 11,21-дикапроната преднизолона. Нагрузка составляет 0,3 г/л, продолжительность гидролиза 48 ч. Выделение целевого продукта проводят аналогично примеру 2. Получают 0,52 г (89,2%) преднизолона с т.пл. 208-215^оС, после перекристаллизации из ацетона, т.пл. 231-234^оС, [α]_D²⁰ + 100^о (с 1, диоксан). Использование предлагаемого способа получения 11 β-гидроксистероидов путем микробиологического гидролиза их ацилатов с помощью культуры Corynebacterium mediolaum обеспечивает по сравнению с существующим способом следующие преимущества: в случае гидролиза 11 β-ацетатов увеличение нагрузки субстрата (в 8 раз по сравнению с известным способом и сокращение продолжительности гидролиза (в 4 раза по сравнению с известным способом), что существенно повышает производительность процесса; возможность проведения микробиологического гидролиза 11 β-ацилатов с С > 2; кроме того, применение культуры Corynebacterium mediolaum для гидролиза 11 β-ацилатов стероидов расширяет ассортимент используемых для этой цели культур.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11 β -ГИДРОКСИСТЕРОИДОВ, включающий предварительное выращивание трансформирующей культуры микроорганизмов и микробиологическую трансформацию II β - ацилоксистероидов в II β - гидроксистероиды с последующим их выделением, отличающийся тем, что, с целью интенсификации, ускорения процесса, а также расширения технологических возможностей способа за счет использования II β - ацилоксистероидов, содержащих C₂ - C₇-ацильные остатки, в качестве трансформирующей культуры микроорганизмов используют Corynebacterium mediolanum ВКПМ В - 964.

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:ГУП "Всероссийский научный центр по безопасности биологически-активных веществ"

(73) Патентообладатель:ООО "Научно-производственный комплекс Пульмомед"

Договор № 21347 зарегистрирован 10.10.2005

Извещение опубликовано: 20.12.2005        БИ: 35/2005

QZ4A - Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): ООО "Научно-производственный комплекс Пульмомед"

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): ЗАО "АСГЛ-исследовательские лаборатории"

Характер внесенных изменений (дополнений):Определение сторон

Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения: 13.01.1998 № 6505

Извещение опубликовано: 10.01.2007        БИ: 01/2007

* ИЛ - исключительная лицензия НИЛ - неисключительная лицензия

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.07.2006

Извещение опубликовано: 27.06.2007        БИ: 18/2007

---