Способ получения l-валина

 

Изобретение относит я микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты L взлина который может быть использован в пкщевой, хпм ческой промышленности и медицине Цепью изобретения является повышение выхода продукта Способ заключается в том, в качестве предке итог- 1-валина ИСЛ ЬЗУЮТ штампы бактерий рода Brewlbacterlurn оЬладачлцие устойчивостью к «идроксзмлу L-af-гинина или устойчивостью к гидроксамаг/ L-аргинина и одновременно к высоким концентрациям ог-эминомдглчний кислоты ЬтК) ь присутствии L чейцина Мутаи j, х с чиьые к гидродами L-aprnHVr3 (шта лм ВКПМ В-3713), накапливают ь t vu жидкости до 17 г л (.-ва i;s стойчив.1Э идоокся б L ар книна и однивр мерно к четким KO-(I;C чтоациям АМК. Р прис/ |Вим I пеи д is (штаммы ВкПМ Б-3714 и ВгПМ до 55 г/л. 1 табл. сл (Г

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4162981/13 (22) 24.12.86 (46) 07.09.91. Бюл. М ЗЗ (71) Научно-исследовательский технологический институт аминокислот (72) А.Г. Азизян, Г,Е. Аветисова, А.В. Арушанян и LU.M. Кочарян (53) 663. 15(088.8) (56) Патент Англии М 1433294, кл. С 12 P 13/08, 1976. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ВАЛИНА (57) Изобретение относи.r.я к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты L"валина, который может быть использован в пищевой, хими-ческой промышленности и медицине.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты L-валина, который может быть использован в пищевой, химической промышленности и в медицине.

Целью изобретения является повышение выхода продукта.

Способ заключается в следующем.

В качестве штаммов — продуцентов используют мутанты бактерий рода

В revibacterlum, обладающие устойчивостью к гидроксамату L-аргинина или устойчивостью к гидроксамату L-аргинина и одновременно к высоким концентрациям

rl-аминомасляной кислоты (АМК) в присутствии L-лейцина, Примерами штаммов — продуцентов !валина являются следующие мутанты бактерий рода Brevlbacterlum. депонированные

„., SU„„ 1675327 À1 сюцз С 12 P 13/08//(С 12 P 13/08, С 12 R 113) Целью изобретения являетеч повышение выхода продукта. Способ здклзчдeтся в том, «to в качестве продуценгов -вдлича

ИСП >ЛЬЗУЮТ ШтдММЫ бактЕР лй РОДа

BrevibaCterlum, ОбЛадд ОцИЕ УСТОЙЧИВОстью к i идроксдмд1у -д! Гининд или устои чивостью к гидроксдмату L-àðrèíèía и одновременно к высоким концентрациям

cz-дмичомдгляной ки"..лотк j. МК) b прис) Tctвии L-. åéöèía Мутан -i, 1 с.::.«иные к гидроксэма у L-дргиникд (шта лм ВКПМ

В-37131, накапливаю- e ул . «рдлГ ной жидкости до 17 г/л! -вд, v,,, утдны, устойчив.зз . Гидрьксд ai -др ич лна и однО6р ме1 HQ к в -яким ко fl.,c 4Trjaöèÿì

ЛЮК Р, прису-:.:Твин L"лен „:,:ч д (ш гаммы

В КПМ В-3714 и B i, ilvl i-3 7151, — до 55 г/л.

1 табл. во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов: штамм В. flavum АА52, зарыистрировднчый год номерам ВКПМ

В-3713: штамм В. Т!д um АЛ53. ззрегистрировднный под номером ВКПМ В-3714; штамм В. flavum АА54, зарегистрированный под номером ВКПМ В-3715

Указанные штаммы получены генети оселекционными приемами из шгамма В, flavum АТСС 14067 (коллекционный номер

ВКПМ В-42), Предлагаемый способ при использовании мутантов бактерий рода Brevlbacterium, уСтОйчивых к ГидрОкСдмдту -дргининд, обеспечивает выход L-валин дс 17 г/л. Конкретным примерам. такого му1ан1а является штамм — продуцент I-валина В. flavum

ВКПМ В-37!3. Испол.зовдние мутантов бактерий рода Brevlbacterd>m, устой <ивых

1675327 мутагенеэ НГ и отбор мутантов, устойчивых к

АМК (55 мг/мл) в присутствии

L-лейцина одновременно к гидроксамату L-аргинина и к высоким концентрациям АМК в присутствии L-лейцина, позволяет достигнуть уровня накопления L-валина в культуральной жидкости по 55 г/л. Примерами таких мутантов могут служить штаммы — продуценты

L-валина В. flavum ВКПМ В-3714 или BVllM

В-3715.

В качестве родительских штаммов для селекции используемых мутантов могут быть любые штаммы бактерий, относящихся к роду Brevlbacterlum.

Эффект увеличения продукции L-валина может быть достигнут также в сочетании с другими известными мутациями, способствующими накоплению L âaëèíà в культуральной жидкости (например, в результате мутации недостаточности по L-изолейцину).

Конкретная схема селекции штаммов— продуцентов L-валина:

ATCC 14067 (ВКПМ В-42): (родительский штамм, продуцирующий до 2 г/л

L-валина) м1(тагенез N-метилN --нитро-N-нитрозогуанидином (НГ) и отбор мутантов, нуждающихся в 1-иэолейцине для роста

АА50 (изолейциновый ауксотроф. продуцирующий до 4,5 г/л (-валина) мутагенеэ НГ и отбор мутантов, устойчивых к гидроксамату L- аргинина (10 мгl мл)

АА52 (ВКПМ В-3713) (изолейциновый ауксотроф,устойчивый к гидроксамату

L-аргинина, продуцирующий до 17 г/л

L-валина) АА53 и АА54 (ВКПМ В-3714 и

ВКПМ В-3715) (иэолейциновые ауксотрофы, устойчивые к гидроксамату 1-аргинина и устойчи— вые к высоким концен5

Г

55 трэциям AMK в присутствии 1-лейцина, продуцирующие до 52 — 55 г/л

L-валина)

Согласно предлагаемому способу в качестве штаммов — продуцентов L-валина используют мутантов, устойчивых гидроксама у 1-apr»v«. а. Кроме того, в качестве ытаммов — продуцентов 1-валина используют мутантов, усгоичивых к высоким концентрациям АМК в присутствии L-лейцина, т е, обнаружено, что высокая валинпрс дуцирующая способность достигается на средах с высокими концентрациями AMK (55 мг/мл) только в присутствии -лейцинэ выход L-валина у штаммов В f1avum ВКПМ

В-3714 и ВКПМ В-3715 повышэегся по отношению к исходному штамму от 17 до 5255 г/л.

Штаммы В. flavum ВКГ M В-3711 ВК;1М

В-3714 и ВКПМ 8-3715 являются также мутантами, нуждающимися a L-иэолейцине для роста. Мутации устойчивости к высоким концентрациям AMK в присутствии L-лейцина и к гидроксамату L-аргинина и ауксотрофности по L-иэолейцину могут быть получены с помощью мутагеииэации ба:;— терий nloC ° > известным способом напр.. мер, обрэооткой НГ или ультрафиолетовым облучением).

Штаммы стабильно сохраняют свои генетические маркеры (устойивость к гидрооксамату L-аргинина, устойчивость к а-аминомасляной кислоте р присутствии 1лейцина и ауксотрофность по L-иэолейцину) и валинпродуцирующую активность в обычных условиях хранения, т.е. при посеве уколом в полужидкий агариэованный МПБ с последующим хранением под лоем ваэелинового мэгла как в холодильнике (4 — 8 С), так и при комнатной темпера ре в течение

1 года, хранении посевом на скошенном

МПА в холодильнике в течение 1 — 2 мес.

Частота реверсии по признаку ауксотрофности по иэолейцину у всех оех штаммов— продуцентов равна 1-3 х 10, ревертантов по остальным двум генетическим признакам в процессе 1,5-годовой работы с продуцентами не обнаружено.

LUTaMh ы В. flavum ВКПМ В-3713, ВКПМ

B-3714 и ВКПМ В-3715 имеют следующую характеристику, Культурально-морфологические признаки, Клетки овальные длиной 1,7-2,5 мкм, бесспоровые, неподвижные, грамположительные.

Мясо-пептонный агар. На 2-е сутки рос та при 28 С колонии диаметром 3-4 мм, круглые с гладким краем, центр приподнят

1675327 в виде конуса, поверхность гладкая, блестящая. цвет желтовато-кремовый.

Штрих на мясо-пептонном агарв. На 2-е сутки рост умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, плотная, цвет желтоватокремовый.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре умеренный, в ocHQBHoM на поверхности среды.

Минеральная среда Гловера с глюкозой, Для роста необходим биотин, тиамин и

L-изолейцин. На 2-е сутки роста при 28 С колонии диаметром " мм, цвет светло-кремовый. Рост штриха на 2-е сутки умерен ный, плотный, цвет све-ло-«ремооый.

На картофеле рост v. образование пигмента с желтым оттенком.

Желатин не раэжижа". г.

ФизиолоГо-бипхими веские признаки, Отношение к источникам углерода, Хороший рост на глюкозе, сахарозе, мальтозз, фруктозе, аННоае; слабее на галактоэе, рамнозе, сорбозе, сорбите, аммонийной и натриевой солях уксусной кислоты, этиловом спирте; не используют лактозу.

Отношение к источникам азота: ассимилируют аммонийный азот и мочевину, Г1олучение штамма "- flaviim ВКПМ В3713.

Штамм В. fiavum РТС.. 140б7 выращивают в мясо-пепто11но - бульоне (МПБ) при

30 С с аэрацией цг рог-...к -I-n титра 10 клеток/мл, Клетки стм в ют о- М 1 = IIPHTрифугированием и рес/спендирую. в ц. тратном буфере (рН 5,5). К полученной суспенэии добавляют НГ дс конечной к цЕнтрации 300 мк /мл, инкубируЮ1 С азрацией в течение 20 мин при 30 С. Затем клетки отмывают от му агена охлажденным

МПБ, переносят в пробирку и 10 мл МПБ, инкубируют с аэрацией 18 ч при 30 С и затем рассеивают на среду М 1 состава, мгlмл: глюкоза 20; N32504 2; К НР04 3;

КН2Р04 1; NH4CI 3; КН4МОз 1; MgS04 х х7Н20 0,1; MnS04 х 5HzC 1 х 10; биоти„

-5, -4

5 х 10; тиамин хлорид 1 х 10, L-I4çoëåéöèí

0,2; агар-агар 20; рН 7,4. Среди колоний, выросших на этой среде после 48 ч инкубации при 30 С, отбирают мутант, не способный к росту на среде ¹ 11, которая не содержит L-изолейцин, Полученный иэолейциновый ауксотроф, обозначенный Е. йауот АА50, вновь обрабатывают НГ и высевают на среду М 1, содержащую также гидроксамат L-аргинина в концентрации

10 мг/мл. Колонии, выросшие на этой среде после 72 ч инкубации, расчищают и проверяют их валинпродуцирующую способность. Один из отобранных таким образом

MvTaHToB, продуцирующий L-валин, обозначен В, fiavum ВКПМ В-3713, Получение штаммов В, flavum ВКПМ В3714 и ВКПМ В-3715, 5 Штамм ВКПМ В-3713 мутагенизируют

Hl и рассеивают на среду М 2 следующего состава, мгlмл: глюкоза 10; NazS04 2;

К2НР04 3; KHzPO4 1; NH4CI 3; ИН4МОз 1;

Му504 х 7Н20 0,1; MnSO4 х 5Н О 1 х 10

10 i=eh04 х 7Н20 1 х 10; биотин 5 х 10, тиамин хлорид 1 х 10; 1.-иэолейцин 0,2; 1 -лейцин

-4.

0,2; 4МК-55; агар-агар 20. Выросшие колонии очищают и проверяют их валинпродуцио",ющ ю способность в условиях колбочных

15 ферментаций, Два из таких мутантов, Ilpoдуцирующие повышенные количества 1-ваiIèHa, обозначены как В.flavuin ВКПМ

&:и14 и ВКПМ В-3715.

Посевной материал штаммпв — проду20 центов для последующей ферментации може быть приготовлен любым известным способом; таким, как вь1ращивание на поверхности твердых агаризованных питательных сред в жидких питательных средах, 25 содержащих у".вояемые источники углерода, азота, неорганические соли и органичегкие вещества обеспечивающие рост микроорга:-:и.". ."в.

В качестве . .1-то«ников углерода могут

30 бЫтЬ ИСПОЛьэ:- нЬ1 ЭКИЕ уГЛЕ ЗдЫ, КаК Сахароза, глн:оэ-. фру« .за . ;-л,тоза, маннсза, кра«- = . ги,.„п л1433 «рахмала и мс,131.са; мн-.: сатэм ыг- спир.1 ы, такие как гли14 .рчн I" тоГи-: o I,:.I 1еские кислоты такие, клк м" г звь ная кислота. уксусная кислота,,". о очная кислота, фумаровая кисии 3 малеиновaя к "1с лога, про пионовая кислота; спирты такие. как метанол и этан1.л, Указанные источники углерода могут

40 быть использованы как в отдельности, так и в сочетании друг с другом в различных весовых соотношениях. Общее количество исгочника углерода может бы-ь введено вначале фермер ации либо порциями в про45 цессе ферментации

В качестве источника азота могут быть использованы как органические, так и неорганические соли аммония, например сульфат аммония, хлорид аммония, карбонат

50 аммония, ацетат аммония, нитрат аммония, фо". рат аммония, лактат аммония, аммоний, мо:евина, различные природные азотсодержащие соединения, например пептон, гидролизат дрожжей, мясной экстракт и

55 гидролизаты растительных белков, В качестве неорганических солей могут быть использованы фосфорнокислый калий. фосфорнокислый натрий, сульфат магния, хлорид .:атрия, соли .елеза и марганца, карбонат кальция.

1675327

В качестве органических веществ, необходимых для роста названных штаммов, могут быть использованы тиамин (например, в форме гидрохлорида или бромида), биотин или его заменители (например, дестиобио- 5 тин, биоцин, 7,8-диаминопеларгоновая кислота), а также аминокислоты, если они необходимы для роста микроорганизмо з, например L-изолейцин. При условии нал,-1чия органических веществ в достаточном ко- 10 личестве в сос1аве других компонентов питательной среды необходимость внесения таких органичное .«х веществ в чистом виде отпадает, Ферментационная среда содержлп,: /л;

Сахароза или глюкоза 100 -200

Сульфат аммония 0»-80

Сульфат магния 0,5 - 0

Калий фосфорнокислый однозамещенный 05 -10 «0

L-иэолейцин О, 1",,4 а также сульфат железа, сульфат марганца, биотин, тиамин. Накопление L-валина наблюдается через 6-8 ч после начала ферментации. Однако максимальный уровень 25

L-валина в культуральной жидкости достигается в результате полного поребпе -ия источника углерода ч;нергии (через 26 -. 1 более после начала ферментации е зависимости от использованной концентрации ис точника углерода и энергии).

Одновременно с валином в куль-ураль. ной жидкости i,акапливается ряд ам чюкислот, Содержание аминокислот е культуральной жидкости штаммов-и роду- 35 центов В. flavum ВКПМ R-3714 и ВКПБ

В-3715 приведено в таблице, Содержание L-валина в культуральной жидкосги и других растворах определяют с помощью метода бумажной хроматогоафии и окрашивания нингидрином или с помощью аминокислотного анализатора.

Накопленныи 1 -валин может быть выде лен из культуральной жидкости лю .. ым vaвестным способом, таким как удаление 45 микроорганизмов и других нерастворенных частиц центрифугированием или фильтрацией, адсорбцией L-валина на ионообменные смолы с последующими элюированием, концентрированием и кристаллизацией L- 50 валина.

Пример 1. Посевной материал штамма В, flavum ВКПМ В-3715 готовя следующим образом B пробирки, содержащие

10 мл стерильного МПБ (рН 7,5) асептие 55 ски вносят петлей культуру, выращенную на поверхности МПА, пробирки инкубируют на качалке в течение 16 ч, В ферментациснные колбы о ;:ьемом

500 мл асептически разливают по 15 мл простеризированной ферментационной средыили следующего состава, г/n, сахароза 150; (NH4)ZS04 55: КН2Р04 0,1; MgS04 Х 7Н20 1;

СаСОэ50; FeS04x7Н 00,01; MnS04x5Н О

0,01; биотин 0,0005; тиамин хлорид 0,0005:

L-изолейцин 0,25; рН 7, В колбы вносят по 1 мл посевного мате-!

:anà з., - мма ЗКПМ Р-3715 и инкубируют на качалке (220 об/гвин) в .:ечение 96 ч при

30»С, Содержание L-валина е культуральной жидкости, полученной поппе завершения фермен ации 55 3 r/n, 250 мп полученнои культу,»альной жид о . и, содержащей 13,8 г : -еепина, цен риф,; ируют >00 об/мин в течени 20 мин) для упаления f nктерий и других не эстеоримых частиц Полчче. ный супернэтлнт пропускаю чеоез;.ол н1»v с ионообменной смолой в +

Ь Форм. е напраьпении снизу- вверх со

I:Kopoc 1ьО 0,6 n6beM0i3 раствора ня 1 обьем смолы за . ч, Колонну промывают водой н эпюируют ад;;орбироеанный L-еапи 3,5- ныл

? îäü ûì пасвсоом аммиака. Полученный эпюа- концеитрируот под вакуумом до пояеле:ня крис =.nnîa и дальнейшую кристалпизэ;хи,.> 1..-папи;. асущестепяют при 5 С е ,ение . . ч. Кристаллы о гепяют от раство;%г:,:i i!ia!,"„:.;a pез 6,:ма>:..нь|й фильтр

1 сушат:,, вак умом. В „хчд ) -валина со-,; алеет 4,7 г без учеза его содержан,я в ато;нем —.ст»о,1е, что да.-т общий выход рТ ос Qep at ип е куль чрапьной;ж.»!/!Kcст л г 3 ОР 1иьто»та ород;к;а,о панн:; бумажной .-.рома1оп афин ;16,6),, П р 1. и;. 2, Ппоцесс и .iiaîäÿT ана логично прим,py 1, топькo е качестве прсдуцента L-валина используют штамм В. fiavum

ВКПМ В-3714, в концентрацию сахарозы в ферментационной среде берут равной

120 г/n. Содержание -валина в культуральной жидкости после 72 ч инкубации составляет 41,7 г/л.

l .-. и м е р 3. Процесс проводят анапсч и ulu поимеру 2 только е. качестве проду снтл -в:. и ина ио ользую", »тамм В. flavunl

ВКПМ й-. 15. Содержание L-валина з ..упьтурапьн »й жидкости по,.пе 72 ч инкубации состввляеT 43,5 г/л, П р и л е р ь Процесс r ооводят аналэгичн» . пример1 1 только в качестве продуце гав-валина исп . ьэуют ш-.гмм В, flavunl

БКР Б В :71 -.. Выход L-вапина составляет

52,7 г/л.

П р ; м е р 5. Процесс роводят аналогично примеру 1, только в качестве продуцентa L-валина используют штамм В. flavue

ВКПМ Б-37 l3. Содержание L-валина в кульгур»елы- зй жид<ости 1 7,2 г/n.

1675327

Редактор И.Дербак Техред M.Mîðråíòàë Корректор Э.Лончакова

Заказ 2976 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Пример 6. Процесс проводят аналогично примеру 1, но е качестве ферментационной питательной среды используют среду следующего состава, г/л: меласса 220; гидролизат БВК (паприна) 80; КН2РО< 1; SO4 20; мел. 5. Выход

l -валина у штамма ВКПИ В-3714 24,8 г/л, а штамма ВКПМ В-3715 26,7 г/л.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно повысить выход продукта и снизить его себестоимость, Формула изобретения

Способ получения L âaëèía. предусматривающий выращивание микроорганизма— продуцента из рода Brevlbacterlum в условиях аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и ростовые факторы.

5 до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением и очисткой, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода продукта, в качестве микроорганизма — проду10 цента из рода Brevlbacterlun используют штамм Brevlbacterlun flavum

ВКПМ В-3713 или ВКПМ В-3714, или

ВКПМ В-3715.