Способ выявления пептидов при изоэлектрофокусировании в полиакриламидном геле

 

Изобретение относится к биохимии и касается способа выявления пептидов при изоэлектрофокусировании в полиакриламидном геле. Целью является повышение чувствительности при определении изоэлектрической точки пептидов с мол.м. ниже 10000. Способ осуществляется изоэлектрофокусированием пептидов в борат-полиольной системе в полиакриламидном геле, фиксацией и окрашиванием гелей в 0,1-0,15%-ном растворе бриллиантового голубого в 20-30%-ном метаноле, содержащем 3-7% глутарового альдегида и обесцвечивают в 0,3-0,5%-ном растворе глутаральдегида в 20-30%-ном метаноле. 4 шт., 1 табл. Q $

ОСЮЗ СОВЕТСКИХ

NUW

РЕСПУБЛИК

А1,.SU„„

yg)g G 01 N 27/26 Q .,»Ц где», »

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4703125/14 (22) 26.04.89 (46) 15.09.91. Бюл. Р 34 (7i) 2-й Московский государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова и Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии (72) Е.М.Воронин, А.И.Довгий, Н.В.Адрианов и Г.Ю.Ажицкий (53) 612.015 (088 ° 8) (56) Остреман Л.А. Методы исследования белков и попклеточных кислот, М,: Наука, 1981, с. 93. (54) СПОСОБ BEKBJIEFEM ПЕПТИДОВ ПРИ

ИЗОЭЛЕ1ТРОФОКУСИРОВАНИИ В ПОЛИАКРИЛЫ6ДНОМ ГЕЛЕ

Ф

Изобретение относится к медицине, а именно к биологической химии, и ка. сается способа выявления белков при изоэлектрофокусировании .в борат-поли ольной системе в полиакриламидном геле.

Целью изобретения является опреде ление изоэлектрической точки белков низкомолекулярных.пептидов.

Пример 1. Хнмотрипсинолиз бычьего сывороточного альбумина проводят по следующей методике: 100 мкг белка растворяли 100 мкл дистиллированной воды и по каплям добавляли

100 мкл 0,2 М И-метил-ацетатного буфера до рН 8,1. После этого добавляют 2 мкг химотрипсина, растворив его предварительно в 2 мкп дистиллированной воды. Пробирку закрывают пара- . фипьмом и перемешивают при 37 С в течение 4 ч. После окончания химотрип2 (57) Изобретение относится к биохимии и касается способа выявления пептидов при из о зле ктрофокусированни в полиакриламидном геле. Целью является повышение чувствительности при определении изоэлектрической точки пептидов с мол.м. ниже 10000. Способ осуществляется изоэлектрофокусир ованием пептидов в борат-полиольной системе в полиакриламидном геле, фиксацией и окрашиванием гелей в О, 1-0,15%-ном растворе бриллиантового голубого в

20-30% †í метаноле, содержащем 3-7% глутарового альдегида и обесцвечивают в 0,3-0,5%-ном растворе глутаральдегида в 20-30%-ном метаноле. 4 ил., 1 табл.

1 синолиза на концентраторе фирмы "Аппcon" с фильтром рМ-10 из пептидной смеси отделяют фракцйи пептидов с мол.в. менее 10000 Д.

Стеклянные трубки с внутренним диаметром 4 мм и длиной 17 см помещают в виде пакета в химический стакан. Непрерывный линейный градиент рН создавали путем смешивания с помощью градиентного смесителя Ultrogzàé" (ЬКВ швеция) в определенных концентрациях трис-боратного буфера рН 7,0, содержащего борную кислоту

О, 1 М (трис-Гидроксиметил), метиламин 0,039 М, мочевину 6 М, смесь акрил-бис/акриламид (30- 1, 2) 5% и

55% раствора глицерина в этом же буфере, после чего его рН снижалось до

4,0..Проводят подслаивание перисталь- тическим насосом буферной смеси, начинал с самой щелочной, в химический

16 77599 стакан. Заполнение проводят в термостате при: = 25 С с последующей фотополимеризацией в течение 4 ч при

Т = 20 С под действием 0,157. рибофла5 вина и О, 0387 тетраметиленэтилендиамида.

Изоэлектрофокусирование с целью определения количества пептидов после химотрипсинолиза бычьего сыворо0 точного альбумина проводят в течение

26 ч. На щелочной торец столбика геля наносят 100 мкл пептидной смеси с мол. в. менее 10000 Д. Стеклянные трубки со столбиками геля подключают к источнику постоянного тока при градиенте потенциала 30 В/см. После окончания изоэлектрофокусирования гели извлекают из трубок с помощью вакуумного насоса и окрашивают в одном случае О, 1--ным раствором кумасси бриллиантовый голубой R-250 в 507-ном этаноле и 107-ной уксусной кислоте в о течение 4 ч при Т = 20 С с отмыванием в 6Х-ной уксусной кислоте в течео ние 4 ч при Т = 20 С с отмыванием в

6Х-ной уксусной кислоте, в другом случае — О, 1Х- íûì раствором кумасси бриллиановый голубой R-250 в 25 .-ном метаноле и 5Х-ном глутаровом альдегио 30 де в течение 4 ч при Т = 20 С с отмыванием в 257-ном метаноле и 0,4Х-ном глутановом альдегиде.

На основании сравнительного сканирования на лазерном денситометре гелей проявляется полоса сфокусирован- 35 ных пептидов, отсутствующая в известном способе (фиг. 1 а, б).

Пример 2. Изофокусирование пептидов после химотрипсинолиза аль- долазы с последующим отделением на фильтре РИ- 10 фракции пептидов с мол.м. менее 10000 Д проводят в тех же условиях, что и в примере 1, используя в фиксирующем красителе по данному способу глутаровый альдегид 45 в концентрации 77, а в атмывающем растворе — О,ЗХ.

Па основании сравнительного сканирования на лазерном денситометре гелей проявляются две полосы сфокусиро-. 50 ванных пептидов при полном отсутствии полос в известном способе определения (фиг. 2 а, б), Пример 3. Изофокусирование

55 пептидов после химотрипсинолиза каталазы с последующим отделением на фильтре PH-10 фракции пептидов с мол.в. менее 10000 Д проводят в тех же условиях, что и в примере 1, используя в фиксирующем красителе по данному способу глутаровый альдегид в концентрации 37., а в отмывающем растворе — О,ЗХ.

На основании сравнительного сканирования на лазерном денситометре гелей проявляются три полосы сфокусированных пептидов при полном отсутствии полос в геле по известному способу определения (фиг. 3 а, б) .

Пример 4. Изофокусирование с целью определения количества пептидов после химотрипсинолиза бычьего сывороточного альбумина с последующим отделением на фильтре РИ 10 фракции пептидов с мол.в. менее 10000 Д проводили в тех же условиях, что в примере 1, используя в фиксирующем красителе по данному способу О, 157-ный раствор кумасси бриллиантовый голубой R-250 в 207-ном метаноле и 5Х-ном глутаровом альдегиде (фиг. 4a) и

0,15Х-ный раствор кумасси бриллиантовый голубой R-250 в 307-ном метаноле и 5Х-ном глутаровом альдегиде (фиг ° 4б).

На основании сканирования на лазерном денситометре гелей показано, что использование в фиксирующем красителе 0,15 -ного раствора кумасси бриллиантовый голубой R-250 и. 20 и

307-ного метанола не ведет к изменению пенситограмм.

В результате проделанной работы показано, что по сравнению с базовым методом получены лучшие результаты для определения изоэлектрических точек пептидов с мол.в. менее 10000 Д.

По сравнению с другими методами изоэлектрофоретического разделения, такими как изоэлектрофокусирование в . амфолитах различных фирм (алфолины фирмы 1.КЕ швеция, сервалиты фирмы

Serva ФРГ, биолиты фирмы BioRad США), предложенный способ дает существенные преимущества для определения низкомолекулярных пептидов. Амфолиты любой фирмы близки по мол.м. и химическим свойствам к низкомолекулярным пептидам и окрашиваются вместе с ними. Поэтому определение низкомолекулярных пептидов при разделении их в амфолитах невозможно.

Предлагаемый способ позволяет определить изоэлектрические точки пептидов, в то время как прототип иэоэлектрические точки пептидов с

1677599

Фигура

Значения изоэлектрических точек

6,20

5,83 4,95

5,93

1а

1б

4,30

4,18

4,30

4,18

6,20

2а

6,80

5,85

6,68

За 6,45

4а, б 6,20

5,83

5,93

5,83 4,95

4,30

4,18 мол.в. менее 10000 не представляется возможным определить вообще (см. таблицу) .

Значения изоэлектрических точек пептидов, определенных в примерах, приведены в таблице.

Формула изобретения

Способ выявления пептидов при изоэлектрофокусировании в полиакриламидном геле путем фиксации геля, окраши1 вания красителем кумасси бриллиантовым голубым 11-250 и его отмывания, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности при определении изоэлектрической точки белков с мол .м. ниже 10000, фиксацию и окрашивание геля проводят одновременно О, 1-0, 15Х-ным раствором краси-!

О теля в 20-307.-ном метаноле содержа0 у щем 3-72 глутарового альдегида и 0,30,52 его в отмывающем растворе °

1677599

1677599

7,0

5;О

Составитель С.Мельникова

Редактор Н.цвыдкая Техред А.Кравчук Корректор Л. Обр учар

Заказ 3319 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, iK-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101