Способ получения холестериноксидазы

 

Изобретение относится к микробиологическому получению ферментов, в частности фермента холестериноксидазы,- который может быть использован в клинических анализах для количественного определения холестерина , и в медицинской практике для снижения холестерина в крови. Целью изобретения является повышение выхода холестериноксидазы и стабилизация холестериноксидазной активности, По изобретению продуцент Streptomyces lavendulae ВКПМ S-834 культивируют на питательной среде, где в качестве источника углерода используют растворимый или нерастворимый крахмал в количестве 5,0-10,0 г/л, в среду вводят минеральные соли, (г/л): СаСОз 1,0-3,0; ( 1,0-3,0; К2НР04 0,5-1,5; БВК 2-5, а в логарифмической фазе роста в возрасте 14-16 ч дополнительно вносят холестерин в количестве 0,02-0,05 г/л. Изобретение позволяет получать выход целевого продукта 2940-4500 ед./л при активности 420-550. ед./г. (Л С

СОК)З СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4749656/13 (22) 27.07.89 (46) 23,09.91, Бюл. М 35 (71) Институт микробиологии АН СССР (72) А.А.Имшенецкий, Г.А.Ширшовв, Л.Н.Мунтян, T,С,Назарова, Л.Е.Никитин, Г,В,Черкасова, Е.П.Яковлева и А,А.Селезнева (53) 663.15 (088.8) (56) Патент СССР М 1026656, кл. С 12 N 9/04, 1983.

Авторское свидетельство СССР

М 1125250, кл. С 12 N 9/04, 1984. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологическому получению ферментов, в частности фермента холестериноксидаэы; который может быть использован в клинических анаИзобретение относится к области микробиологического. получения ферментов, в частности фермента холестериноксидаэы, который может быть применен как реагент в клинических анализах для количественного определения холестерина и в медицинской практике для снижения холестерина в крови.

Цель изобретения — повышение выхода холестериноксидазы и стабилизация холестериноксидаэной активности.

Способ осуществляют следующим образом.

Продуцент Streptomyces lavendulae

ВКПМ S-834 (ВКМ А-840Д) культивируют глубинным способом на среде, содержащей, г/л; крахмал 5,0-10,0; KzHP04 0,5 — 1,5; (NH4)2 SO4 1,0 — 3,0; СаСОэ 1,0-3,0; белково... Ж„, 1678831 А1 (sl)s С 12 N 9/04, 1/20// (С 12 N 9/04, С 12 R t:56} лизах для количественного определения холестерина, и в медицинской практике для снижения холестерина в крови, Целью изобретения является повышение выхода холестериноксидаэы и стабилизация холестериноксидазной активности, По изобретению продуцент Streptomyces lavendulae

ВКПМ S-834 культивируют на питательной среде, где в качестве источника углерода используют растворимый или нерастворимый крахмал в количестве 5,0-10,0 г/л, в среду вводят минеральные соли, (г/л):

СаСОз 1,0 — 3,0; (ИН4)г304 1,0-3,0; КрНРО4

0,5-1,5; БВК 2 — 5, а в логарифмической фазе роста в возрасте 14 — 16 ч дополнительно вносят холестерин в количестве 0,02-0,05 г/л. Изобретение позволяет получать выход целевого продукта 2940 — 4500 ед,/л при ак- у тивности 420 — 550 ед./г, витаминный концентрат 2,0-5,0; вода до 1 л, и по достижении логарифмической фазы роста (14 — 16 ч) в культуральную жидкость вносят холестерин в количестве 0,002 — 0,005%.

Выращивание продолжают до 20 — 24-часового возраста культуры, затем мицелий отделяют и промывают 0,5 М фосфатным буфером с рН 7,0. Иэ биомассы продуцента фермент экстрагируют поверхностно-активным веществом Тритон-Х100. К 2 — 4%-ной суспензии клеток в 0,05 M фосфатном буфере с рН 7,0 добавляют 0.5%-ный ТритонХ100. Экстракцию ведут при 20 С при постоянном перемешивании в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат содержит холестериноксидазу, экстрагированную иэ клеток продуцента Тритоном-Х100.

1678831

Ферментативную активность определяют по образованию холестенона в системе, содержащей 0.,5 M фосфатный буфер с рН

7,0; 0,2 ь-ный,Твин-20; 1,5 мкМ/мл холестерина и экстракт фермента — 0,025-0,1 мл на

1,5 мл смеси, Определение ведут на спектрофотометре, измеряя изменение экстинкции при длине волны 240 нм. соответствующей максимальному поглощению для холестенона. За единицу холестериноксидазной активности принимают количество мкМ холестенона, образующегося под действием холестериноксидазы за

1 мин при 370С

Выход фермента. с 1 л культуральной жидкости составляет 2940 — 4500 ед, холестериноксидазы при урожае мицелия 7,0-9,0 г/л с активностью 420 — 550 ед./r.

При содержании в среде менее 5,0 г/л крахмала урожай мицелия значительно снижается, а внесение в среду более 10,0 г/л крахмала не оказывает влияния на процесс, Холестерин в концентрации от 0,002 до

0,005,ь наиболее эффективен для предотвращения снижения активности холестериноксидазы, вызываемого физиологическими причинами в процессе культивирования Str, laveпdulae ВКМ А-840 Д.

Пример 1. Культивирование продуцента Str. lavendulae ВКМ А-840 Д и подготовку посевного материала проводят на среде следующсго состава, г/л: крахмал нерастворимый 10,0; КгНРО 1,0; (КН )г$04

1,0; СаСОз 3,0; белково-витаминный концентрат 3,0; рН 7,0, Посевной материал готовят в колбах Эрленмейера на 250 мл с объемом среды 70 мл, выращивание ведут на качалке с 180 об;/мин в течение 24 ч при

28 С. Количество посевного материала 10 ф» (об./об.), Культуру выращивают в колбах Эрленмейера на 250 мл с объемом среды 70 мл на качалке с 180 об./мин. Через 14 ч культивирования в колбы вносят холестерин из расчета 0,002;4. Культивирование продолжают до 22-часового возраста, затем мицелий отделяют, промывают 0,005 M фосфатным буфером с рН 7,0. Фермент экстрагируют из мицелия раствором ТритонХ100 и определяют его содержание в экстракте, Холестериноксидазная активность составляет 550 ед./г. Урожай сухого мицелия 8 г/л. Выход фермента 4400 ед./л, Пример 2. Культивирование продуцента Str.lavendulae ВКМ А-840 Д и подготовку посевного материала проводят на среде следующего состава, г/л: крахмал не. растворимый 5,0; КгНРО 0,5; (ИН@ЯО 1,0, СаСОз1,0; белково-витаминный концентрат

2,0; рН 7,0, в условиях, описанных в примере 1. Через 16 ч культивирования в культуральную жидкость вносят 0,003 холестерина и продол>кают культивировать до 20 ч.

Мицелий отделяют, промывают и определяют ферментативную активность, как описано в примере 1. Холестериноксидазная активность мицелия составляет 420 ед,/г, урожай сухого мицелия 7,5 г/л; выход фермента 3150 ед./л.

Пример 3. Культивирование продуцента Str. lavendulae ВКМ А-840 Д проводят в условиях. описанных в примере 1, на среде следующего состава, г/л: крахмал растворимый 10,0; КгНРО4 1,5; (МНд)г304 3,0, СаСОз

3,0; белково-витаминный концентрат 5,0; рН 7,0. Холестерин вносят после 16 ч роста в количестве 0,0047, и выращивание продолжают до 24 ч. Холестериноксидазная ак1С

15 тивность мицелия составляет 500 ед./г, урожай сухого мицелия 9,0 г/л; выход фермента 4500 ед,/л

Пример 4. Культивирование Str.

lavendulae BKM А-840 Д проводят в круглых колбах на 3 л с 0,5 л среды на качалке с 190 об,/мин. Посевной материал готовят в колбах Эрленмейера на 250 мл с 70 мл среды, при посеве используют 14% (об./об,) 24-часовой культуры. Применяют среду следующего состава, г/л: крахмал растворимый 5,0;

КгРО4 1,0: (КН4)г504 1,0; СаСОз 2,0; белково-витаминный концентрат 2,0; рН 6,9. Холестерин вносят в 16-часовую культуру в

30 количестве 0,0057; и выращивание продолжают до 22 ч, Мицелий отделяют на центрифуге при 5000 об./мин, промывают и

35 определяют ферментативную активность

Холестериноксидазная активность мицелия составляет 420 ед./г; урожай сухого мицелия 7,0 г/л; выход фермента 2970 ед,/л.

Пример 5. Культивирование Str, lavenduIae BKM А-840 Д проводят в условиях, описанных в примере 1, используя среду следующего состава, г/л: крахмал нераство40 римый 8,0; KzHPO4 1,0; (МН4)гЯО42,0; СаСОз

2,0: белково-витаминный концентрат 4,0; дазная активность мицелия составляет 400 ед./г; урожай сухого мицелия 8,5 г/л; выход фермента 3400 ед./г.

Изобретение позволяет предотвратить быструю инактивацию фермента и повысить его выход в 2 — 3 раза.

Формула изобретения

Способ получения холестериноксидазы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента Streptomyces

lavenduiae ВКПМ S-834 на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, углекислый кальций, белково-витаминный

45 рН 6,9. Холестерин вносят в 15-часовую культуру в количестве 0,003% и выращивание продолжают до 22 ч. Холестеринокси1678831

Составитель Е.Воробьева

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н.Король

Редактор Н.Яцола

Заказ 3183 Тираж 361 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101 концентрат и воду, с последующим выделением фермента из клеток, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что. с целью noBblwGHMA выхода холестериноксидазы и стабилизации холестериноксидазной активности, в качестве 5 источника углерода в питательной среде используют крахмал, в качестве источника азота — сульфат аммония, дополнительно в среду вносят двузамещенный фосфат калия при следующем соотношении компонентов, г/л: крахмал 5 — 10; углекислый кальций 1 — 3; сульфат аммония 1-3; двузамещенный фосфат калия 0,5-1,5; белково-витаминный концентрат 2-5; вода до 1 л, при этом в логарифмической фазе роста вводят холестерин в количестве 0,02-0,05 г/л.