Способ выделения реснитчатых клеток животных

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине. Цель изобретения - повышение чистоты выделения реснитчатых клеток. После извлечения и промывки ткани животного ее обрабатывают соединением, активизирующим движение клеточных ресничек. Затем остатки ткани удаляют, а реснитчатые клетки осаждают. 1 з.п.ф-лы. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОЬГЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4716114/13 (22) 20,06.89 (46) 15.10.91. Бюл. %38 (71) Тихоокеанский океанологический институт Дальневосточного отделения АН

СССР (72) А, В.Сизов (53) 586 (088.8) (56) Murakami А., Ishizaka $.

Tritluoroperazine, W-7 and ЧЧ-5 do not inhibit

the calium dependent arrest response of triton — extracted lateral cilia on the gill of Mytilis—

j.Fac.Sic.Uniw. Tokyo, 1985, ч.16, М 1, рр, 59 — 65.

Мораска Л., Эрба Э. Проточная цитометрия, — В кн.: Культура животных клеток, Методы. M.: Мир, 1989, с. 182 — 213, Изобретение относится к биотехнологии, направлено на препаративное получение изолированных реснитчатых клеток, и може быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине при тестировании цитотоксичности факторов среды и химических соединений.

Целью изобретения является повышение чистоты выделения клеток.

Способ осуществляют следующим образом.

Извлекают ткани из животного, промывают ее, обрабатывают ткани в растворе дезагрегирующих веществ, активизирующих движение клеточных ресничек, удаляют остатки ткани из полученной клеточной суспензии и осаждают реснитчатые клетки. В качестве дезагрегирующих веществ используют соединения, активизирующие движение клеточных ресничек, Для повышения

„„Ж „„1684336 А1 (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕСНИТЧАТЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине, Цель изобретения — повышение чистоты выделения реснитчатых клеток. После извлечения и промывки ткани животного ее обрабатывают соединением, активизирующим движение клеточных ресничек, Затем остатки ткани удаляют, а реснитчатые клетки осаждают. 1 з.п.ф-лы. выхода реснитчатых клеток используют серотонин в концентрации 5.10 М.

Дезагрегация ткани, содержащей ре- -в снитчатые клетки, происходит за счет изби- Я рательного отделения реснитчатых клеток в Ср результате увеличения частоты биений ре- р сничек реснитчатых клеток. Увеличение частоты биений клеточных ресничек достигается обработкой ткани раствором веществ, увеличивающих частоту биений 0, ресничек. Повышение частоты биений ресничек, находящихся в эпителии клеток, увеличивает гидродинамические силы сдвига между отдельной клеткой с бьющимися ресничками и соседними нереснитчатыми клетками. Из-за увеличения сил сдвига относительно нормы повышается вероятность отрыва от эпителиального слоя тех клеток, у которых увеличена интенсивность движения ресничек. В результате отдельные физи1684336

Препаративное выделение реснитчатых жаберных клеток моллюсков показало, что

90 — 95% клеток полученной суспензии имели бьющиеся реснички, Следовательно, заявляемый способ обеспечивает избирательность выделения и одновременно высокий выход физиологически активных

55 ологически активные реснитчатые клетки вырываются из окружающих их нереснитчатых эпителиальных клеток и переходят в суспензию. Поскольку каждая реснитчатая клетка отрывается от клеточного слоя от- 5 дельно от других клеток, в суспензию не попадают клеточные агрегаты, а только отдельные клетки. Поэтому способ приводит к получению одноклеточной суспензии. Реснитчатые клетки со сниженной физиологи- 10 ческой активностью не способны увеличить частоту биений ресничек. Поэтому эти мэлоактивные клетки не развивают достаточных сил для того, чтобы отделиться от клеточного слоя. Следовательно, отделяются от тка- 15 ни и переходят в клеточную суспензию толькО физиологически активные реснитчатые клетки; Выделенные реснитчатые клетки сохраняют свою нативность„поскольку имеют на своей поверхности бьющиеся ре- 20 снички.

Эксперименты, проведенные с реснитчатыми клетками двустворчатых моллюсков, свидетельствуют, что частота биений ресничек латерэльных жаберных клеток в. 25 покое составляет 10 Гц, а при обработке жабр серотонином частота биений повышалась до 27 Гц, допамином — до 19 Гц. Перфузия жабр двустворчатых моллюсков раствором серотонина с концентрацией от 30

1х10 до 1х10 М приводи к дозозависимому увеличению частоты биений ресничек латеральных клеток. Частота биений этих ресничек в 1х10 М растворе серотонина увеличивается до 20 Гц, в 1х10 М растворе 35 до 22 Гц, в 1х10 М растворе до 23 Гц, в

1х10 М растворе до 25 — 26 Гц. Сходное увеличение активности ресничек вызывают растворы теофиллина, каффеина и изобутилметилксантина. Смеси нескольких веществ могут значительно повышать частоту 40 биений лэтеральных жаберных ресничек. например растворы; 1 мМ теофиллина +

0,005% сапонинэ; 1 мМ теофиллина+ 0.05% сапонина + 0,1 мМ цАМФ (до 25 Гц); 1 мМ теофиллина + 0,01% сапонина + 0,01 мМ 45 цАМФ (до 22 Гц). Все перечисленные вещества и смеси веществ, увеличивающие частоту биений клеточных ресничек, могут быть использованы в предлагаемом способе в качестве дезагрегирующих веществ. 50 нативных реснитчатых клеток, т,е. повышает чистоту выделения реснитчатых клеток.

Пример. Жабры двустворчатого моллюска (приморский гребешок) извлекали, промывали фильтрованной морской водой и обрабатывали растворами серотонинкреатининсульфата в фильтрованной морской воде нормального состава в течение 2 ч при комнатной температуре. Были использованы растворы серотонинкреатининсульфата

5 концентраций: 1Х10-7 М; 5xio-7 М; 1Х10-6

М; 5х10 М; 1х10 М. Соотношение ткань: дезагрегирующий раствор было 1:10 по объему. Из полученной суспензии реснитчатых клеток затем удаляли ткань и центрифугированием в течение 5 мин при 1000g осаждали реснитчатые клетки.

Реснитчатые клетки составляли 90—

95% от всех клеток полученной суспензии во всех случаях, Клетки были физиологически активными, поСкольку их реснички двигались. В случае применения растворов серотонинкреатининсульфата выход реснитчатых клеток составлял: 1х10 М вЂ” 3—

4,5 млн клеток /1 r влажной ткани; 5х10 М и выше — 5 — 6 млн клеток/1 г влажной ткани, При использовании растворов серотонинкреэтиниксульфата выше 5х10 М в получен-7 ной суспензии дозозависимым образом увеличилось содержание изолированных ресничек, обламывающихся с поверхности реснитчатых клеток в результате значительного увеличения частоты их биений.

Следовательно, использование в качестве дезагрегирующего вещества оэстворэ серотонинэ с концентрацией 5х10 M необходимо и достаточно для оптимального осуществления заявляемого способа.

Также могут быть выделены реснитчатые клетки с использованием растворов теофиллина и каффеина. а также смеси нескольких веществ того же ряда, Формула изобретения

1. Способ выделения реснитчатых клеток животных, предусматривающий извлечение ткани из животного, промывку ее, обработку ткани дезагрегирующим веществом, удаление остатков ткани из полученной таким образом клеточной суспензии, осэждение взвешенных клеток, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения чистоты выделения реснитчатых клеток, в качестве дезагрегирующих веществ используют соединения, активизирующие движение клеточных ресничек, 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве дезагрегирующего вещесТВВ используют раствор сератонина в концентрации 5.10 M.