Способ стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения протопластов

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения растительных протопластов. Целью изобретения является ускорение стерилизации при снижении трудоемкости. Способ состоит в том, что ферментные препараты стерилизуют ионизирующим излучением <SP POS="POST">6</SP>°Со в дозе 1,0 - 2,0 мР. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

IsI>s С 12 М 5/04

ГОСУДА Р СТ В Е ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АЗТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4664456/13 (22) 25.01.89 (46) 30.08.91. Бкл. М 32 (71) Центральная генетическая лаб<.:ат.,;.ия им. И.В. Мичурина (72) Н.M.— X. Нафталиев и fi.À. д,:,о;. i:, ;àí (53) 578,085,23 (088.8) (56) Сидоров В.А. и др. Соматическ.ъ:".бридизация пасленовых, Киев: Наукова .", мка, 1985, с. 49-50.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в области культуры тканей и клеток. генетики и селекции для получения качественных протопластов растений, В биотехнологии для получения качественных протопластов растений большое значение имеет сохранение высокой стерильности и активности ферментпы> препаратов, растворяющих клеточные оболочки растений. Основное требование, предъявляемое к стерильности, состоит в том, чтобы все выделенные протопласты, культивируемые на искусственной питательной среде, были не заражены инфекционной микрофлорой и имели шаровидную форму с равномерным распределением хлоропластов.

Цель изобретения — ускорение стерилизации при снижении трудоемкости.

Способ состоит в том. что при стерилизации ферментных препаратов на них воздействуют ионизирующим излучением Со

60 в дозах от 1,0 до 2,0 м Р при мощности

12,0 — 18,0 P/ñ.

50 1673596 А1 (54) СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТHhlX ПРЕПАРАТОВ. ИСПОЛЬЗУЕМЫХ

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения растительных протопластов. Целью изобретения является ускорение стерилизации при снижении трудоемкости. Способ состоит в том, что ферментные препараты стерилизуют ионизирующим излучением Со в

60 дозе 1,0-2,0 мР, 2 табл.

В данном диапазоне мощности гаммаоблучения при заданной экспозиционной дозе облучения эффект в пределах погрешности измерения не меняется.

Способ осуществляется следующим образом.

По 1 г сухого фермента, например

"Pectinase", помещают в пенициллиновые пузырьки и облучают ионизирующим излучением " Со на установке РХМ ) 20 в дозах

1,0 — 2,0 мР при мощности 12,0-18,0 Р/мин.

Пос:e сблучения фермент из пенициллиновых пуырьков растворяют в О," М растворе сахароэы, которую также предварительно стерилизуют автоклавированием при 1,0 атм в течение 20-25 мин. Для гидролизации клеточных оболочек в суспензию растительных клеток наливают стерильный ферментный раствор и инкубируют в термостате при 2628 С б — 16 ч. Осаждение протопластов осуществляют с помощью центрифуги, Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1, Изучают влияние облучения Совдозах0,25Р;0,50Р;1,0Р:20 и

1673596

3,0 мР при мощности 18,0 Р/с на степень стерилизации ферментного препарата

"Pectlnase", взятого в 1;(>-ной концентрации, и влияние стирилизации этого фермента на качественный и количественный выход изолированных протопластов из клеток каллусной ткани земляники сорта "Рубиновый кулон".

Опыт ставят в трехкратной повторности.

Ферментные растворы, облученные указанными дозами, предварительно ставили в термостат на 5 — 6 сут при 28 С для выявления степени стерильности, В качестве контроля служил ферментный препарат

"Pectlnase", растворенный в 0,5 М растворе сахароэы, стерилизацию которого проводили фильтрованием через мембранные фильтры — Milli pore.

Действие ионизирующего излучения на стерилизацию ферментного препарата (мощность дозы 12,0-18,0 P /с) приведено в табл. 1.

Как показывают исследования, доза облучения ферментного препарата 0,25 и

0,50 мР не приводит к желаемому результату, так как раствор на 5 — 6 — и день покрывается плесенью. Ферментные растворы, облученные дозами 1,0; 2,0 P и 3,0 мР, являются стерильными и их используют в дальнейших исследованиях по выделению изолированных протопластов земляники.

Наиболее оптимальной дозой облучения, которая лучше всего стерилизует ферментный препарат и сохраняет его активность, является доза 1,0 мР (см. табл. 1), Плотность жизнеспособных протопластов, выделенных при использовании ферментного раствора. облученного дозой

1,0 мР, составляет 1,5 10 п/мл.

Ферментные растворы, полученные от облучения фермента дозой 2,0 мР, приводят к снижению числа жизнеспособных протопластов и гибели значительной части протопластов, выделенных иэ клеток каллусной и листовой ткани земляники, Ферментные растворы, полученные от облучения фермента дозой 3,0 мР, полностью теряют свою активность и не пригодны для растворения клеточных оболочек.

Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1, только действие простерилизованных ферментных препаратов исследуют на тканях сливы.

Результаты представлены в табл. 1.

Пример ы 3 — 5. Аналогично примерам

1-2 исследуют действие препаратов на получение протопластов из тканей других плодовых культур, Результаты представлены в табл. 2, Предлагаемый способ стерилизации ф рментных препаратов позволяет не применять импортные мембранные фильтры для получения растительных протопластов, что сущетвенно ускоряет рабочий процесс и сокращает затраты труда и денежных средств.

Формула изобретения

Способ стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения протопластов, включающий воздействие на них фактором, обеспечивающим высокий уровень стерильности при сохранении их активности, отличающийся тем, что, с целью ускорения стерилизации при снижении трудоемкости, на ферментные препараты воздействуют ионизирук;щим излучением бо

Со в дозе 1,0-2,0 мР при времени инкубации 16 ч.

1673596

Таблица!

Действие ионизирующего излучения на стерилизацию ферментного препарата

Мощность дозы 12,0 р/ик — 1Е,о р/сек

Источники выделения протопластов

Доза, мР

Характеристика препарата, плотность протопластов в зависимости от дозы облучения, и/мл

1,2 ° 10

Клетки каллусной ткани эемпяники "Рубиновый кулон"

Контроль

Millipore

0,25

Нестерильный

0,5

t,0

2>0

3,0

Клетки листовой ткани сливы сорта мРенклод колхозный>

Контроль

Nillipore

Нестерильный

0>25

2,0

3,0

Летальный исход

П р и м е ч а н и е. Фермент — "Pectinase"> 17,-ный раствор; осмотический стабилизатор — сахароза, 5,0 М; время инкубации 16 ч, Таблица 2

Доэа облучения, МР

Время инкубации> ч эатор

Клетки халлус- Целлобианой ткани яб- эа, 1>OI

Сахароэа

5,0 М лони сорта

"Ренет ЧерненЮ ко"

Cellulaва, 1,OI

Сахарова

5,0 И

Клетки листо- Пектофое- Л-Маннит 16 вой ткани смо- тидин, 0,4 М родины сорта 2,0I

"Память Иичуринан

0,25

0 5

1,0

2>0

3,0

Источник вьщеления протопластов

Клетки каллусной ткани груак сорта "Коперечка"

Зяа 4»>мента и концентра ция> Х

Осмотический стаби!

0,25

0,5 1, 0

2 0

3,0

0,25

0,5

1,0

2,0

3,0

Нестерильный

1,5 106

0,7 10

Летальный исход

0,1 10

Нестерильный

0,7 10

0,2 10

Характеристика препарата, плотность протолластов в эависнмости От Доэы Облучения> л/мл

Нестерильный

>>

4,0 10

6>0 10

Летальный исход

Нестерильный

I>

1,1 ° 10

О> 73 10

Летальный исход

Нестерильный

»

3,4 ° 10

2,4 10

Летальный исход