Штамм х-вируса картофеля х65 для вакцинации растений картофеля

 

Изобретение относится к фитовирусологии, точнее к защите растений от вирусных болезней. Цель изобретения - получение вакцинного штамма Х-вируса картофеля, обладающего большой генетической стабильностью, вакцинирующим эффектом повышенной длительности и способствующего сохранению высокого урожая картофеля. Указанная цель достигается использованием в качестве вакцинного штамма Хб5, депонированного в коллекции штаммов ВНИИЗР под Ms 7. Этот штамм обладает высокой защитной способностью против патогенных штаммов Х-вируса картофеля. 5 табл.

(OIO3 СОВЕ 1СКИХ соци Ал исти Ге ских

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4280881/13 (22) 08.07.87 (46) 30,10.91. Бюл. М 40 (71) Украинский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) Ф.Е.Козар, Н,А.Сиверс и А.А,Агрэнович (53) 576,858.8 (088.8) (56) Рейфман В.г., Романова С.А. Применение слабопатогенного штамма Х-вируса картофеля в опытах по защитной вакцинации. (54) ШТАММ Х-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ Х66

ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ

Изобретение относится к фитовирусологии, точнее к защите растений от вирусных болезней.

Цель изобретения — получение вакцинного штамма Х-вируса картофеля, обладающего большой генетической стабильностью, вакцинирующим эффектом повышенной длительности и способствующего сохранению высокого урожая картофеля.

Штамм Хее ВНИИЗР М 7 характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки.

Размер вирионов 525 нм х 10 нм. Температурная точка инактивации (ТТИ) 76 1 С.

В клетках растений дурмана образует крупнозернистые круглые или овальные Х-тела.

Физиологические признаки, Непатогенен для растений картофеля разных сортов и дурмана Datura stramonlum

L. — растения-индикатора штаммов ХВК. Не

Я2„„1687609 А1 (57) Изобретение относится к фитовирусологии, точнее к защите растений от вирусных болезней. Цель изобретения получение вакцинного штамма Х-вируса картофеля, обладающего большой генетической стабильностью, вакцинирующим эффектом повышенной длительности и способствующего сохранению высокого урожая картофеля. Указанная цель достигается использованием в качестве вакцинного штамма Х65, депонированного в коллекции штаммов ВНИИЗР под М 7.

Этот штамм обладает высокой защитной способностью против патогенных штаммов

Х-вируса картофеля. 5 табл. влияет на их рост и развитие, не выэываег симптомов заболевания. Концентрация штамма Х66 в растениях картофеля и дурмана на 2 — 3 порядка ниже концентрации патогенных штаммов ХВК.

Обладает высокой защитной способностью против патогенных штаммов ХВК. Защищает растения картофеля от заражения сильнопэтогенными штаммами ХВК начиная с седьмого дня после введения штамма

Х66 в эти растения.

Обладает высокой генетической стабильностью и длительным защитным вакцинирующим эффектом. В лабораторных условиях вакцинирующий эффект штамма

Х66 составляет 91 .

Относится к группе слабопатогенных штаммов Х по градации Kohler (1962).

Серологические (антигенные) свойства, 1687609

Обладает высокой антигенной активностью. Титр моноштаммовых диагностических сывороток равен 1;4096-1, 8192, По уровню РНК-азной активности штамм относится к слабопатогенным, PHKаэная активность его близка к уровню PHKазной активности здоровых растений.

Штамм Х65 не снижает урожай картофеля. Урожай картофеля, зараженного шгаммом Xgg, выше на 7,9--20,4% в сравнении с контрольными (здоровыми) растениями.

Культивирование.

Штамм Xgg легко передается механически с помощью карборундэ на растения картофеля, дурмана и др.

Штамм Хы сохраняется в лиофильно высушенных очищенных препаратах без потери инфекционности до трех лет, в листьях картофеля и дурмана, помещенных в насыщенный раствор сахарозы, — более года, в течение шести лет (время наблюдения) сохраняется в клубнях картофеля, передаваясь без изменения патогенности через клубневое потомство.

Пример 1. Изучение симптоматологии штамма Xsg ВНИИЗР ¹ 7 в сравнении с другими различными по патогенности штаммами и изолятами ХВК проводили на двадцати различных видах и сортах растений, в том числе на десяти сортах картофеля, Опыты проводили в условиях теплицы и на опытном участке в течение шести лет.

По 50 — 100 молодых растений в фазе 3 — 5 листьев Datura stramonium 1.; Datura

inermis L.; Datura гпете1 L,; Datura tatula Е„

Gomphrena globosa L.; Nicotlana tabacum, сортов Самсун, Nicotiana sylvestris, сортов томата Украинский тепличный 285, Украинец, Волгоградский 5/95, сортов картофеля

Искра, Невский, Зарево, Мавка, Приекульский.ранний, Адретта, Чаривныця;

Гатчинский, Домодедовский, Луговской заражали слабопэтогенным штаммом Х65 и другими различными по патогенности штаммами и изолятами ХВК. Контроль— здоровые (незараженные) растения. В течение вегетационного периода (двух-трех месяцев) проводили наблюдения за проявлением симптомов заболевания.

Установлено, что штамм Х65 на всех исследованных видах и сортах растений не вызывает симптомов заболевания в течение всего вегетационнсго периода в отличие от патогенных штаммов ХВК, которые на этих растениях вызывают ярко выраженную мозаику с первичными и вторичными некротическими пятнами. Эти растения отстают в росте и развитии.

Пример 2, Изу ение влияния ш гамма

Хгь на рост и развитие растений картофеля и дурмана проводили в сравнении со эдоровы ми (неза раже н н ы ми) растениями и растениями, зараженными сильнопатогенным штаммом XBK.

Молодые растения картофеля сорта Гатчинский первой клубневой репродукции и дурмана 0аыга stramonlum L. в фазе 3 — 5 листьев заражали штаммами ХВК. В период максимального накопления вируса (на 21-й день после заражения) проводили определение.

В табл,1 показано влияние штаммов

ХВК различной патогенности на рост и развитие растений картофеля сорта Гатчинский и дурмана Datura stramonium L.

Установлено, что штамм Xsg не влияет отрицательно на рост и развитие растений картофеля и дурмана, увеличивая по сравнению с контрольными (эдоровыми) растениями их вес на 1,7 и 1,4% соответственно, тогда кэк сильнопатогенный штамм ХВК резко снижает вес этих растений в течение месяца выращивания на 30 и 13% и высоту растений на 38,2 и 12,1% соответственно

Пример 3. Для сравнительной характеристики штамма Х65 с более патогенными штаммами XBK был применен биохимический метод оценки их патогенности, основанный на определении активности

PHK-аэы у зараженных растений.

Использовали растения картофеля сорта Гатчинский в стадии пробирочной культуры, выращенные из клубней первой репродукции (последействие первого года), и дурмана Datura stramonlum 1 ., которые в фазе трех — пяти листьев инокулировали штаммом Xgs и сильнопатогенным штаммом

ХВК. Патогенность штамма Хвь определяли по максимальному значению активности

PHK-азы и сравнивали в процентном отношении с контролем (здоровые растения) и с сильнопатогенным штаммом ХВК, Исследо45 вания проводили в динамике развития инфекции в растениях в течение двух месяцев после заражения и в растениях, выращенных из клубневого потомства зараженного

ХВ К картофеля (табл,2), 50 Выявлено, что уровень PHK-азной активности под влиянием штамма Хвь ниже по сравнению с сильнопатогенным штаммом

ХВК ía 230% (на картофеле) и íà 127% (на дурмане) и приближается к уровню PHK-аз55 ной активности здоровых растений, превышая его на картофеле всего íà 5%, а на дурмане на 11, что свидетельствует о низкой патогенности штамма Xgs.

В табл.2 приведена активность PHK-азы в листьях растений картофеля сорта Гатчин168760". ский и дурмана Datura stramonium L., зараженных штаммами ХВК различной патогенности, Положительная корреляция между патогенностью штаммов XBK и активностью 5

РНК-азы сохраняется в течение всего периода развития инфекции, а также передается через клубневое потомство зараженных, XBK растений картофеля.

Пример 4. Реверсибельные свойства 10 штамма Xgs изучали в течение шести лет на растениях картофеля сорта Гатчинский, оздоровленного методом культуры мвристе.мы, в течение первой — пятой клубневых репродукций, на растениях картофеля сорта 15

Искра четвертой и пятой -клубневых репро дукций и на растениях дурмана Ожога

stramonlum 1 . в течение 15 пассажей.-Исследования проводили на опытном участке и в условиях теплицы. По 10. МЫЛ = 20 дых растений растения-индикатора алзм- мов ХВК Datura stramontum L. зарйжали инокулюмом от растений картофеля разиых клубневых репродукций; растений дурма-: на с разными пассажами штамм а Хе ; лМ- 25 тьев растений картофеля и дурмана с ХаБ, хранившихся в течение четырех лет в насыщенном растворе сахарозы, а также в лиофильно высушенных очищенных. препа ратах штамма Xgg; хранившихся три гада 30 при 4 -1 С, Выявлено, что растения дурмана,-зараженные штаммом Хы, во всех варйантах оставались бессимптомными в течение все-.

ro вегетационного периода, что характерно 35 для симптоматологии штамма Xgg.

Следовательно, штамм Х65 не измейяет своей патогенности в клубневом потомстве на картофеле в течение шести лет (время наблюдения), при 15 пассажах на дурмане и 40 при хранении в лиофильно высушенных препаратах в течение трех лет, т.е. обладает высокой генетической стабильностью.

Пример 5. Опыты по определению вакцинирующего эффекта штамма Хвв проводили в условиях теплицы на растениях картофеля сорта Гатчинский, выращиваемых s вазонах.

Схема опыта.

Вариант 1 — контроль (незараженные растения).

Вариант 2 — растения, зараженные штаммом Х65

Вариант 3 — растения, зараженные штаммом Xm, и на 1 — 10 дни вторично зараженные сильнопатогенным штаммом ХВК.

Вариант 4 — растения, зараженные сильнопатогенным штаммом ХВ К.

В каждом варианте использовали по

100 растений картофеля (по 25 растений в четырех повторностях). Растения заражак1т в фазе 3-5 листьев механически с помощью карборунда. В течение трех месяцев наблюдают за ростом и развитием растений, симптомами, проводят серологический и электронно-микроскопический анализы на наличие вирусов.

В результате проведенных исследований выявлено, что заражение штаммом

Xm предохраняет растения картофеля от сильнопатогенного штамма. Четко проявляется защитная способность штамма

Хы начиная с седьмого дня после его введения в растения (табл.З). Растения, зараженные штаммом Хев (вариант 2), остаются бессимптомными в течение всего периода проведения опыта.

На растениях картофеля, зараженных сильнопатогенным штаммом ХВК (вариант 4), через две недели появляются ярко выраженные симптомы в виде крапчатой пятнистости, морщинистости листьев, первичной и вторичной некротизации. Растения отстают в росте и развитии.

В табл,З дано определение вакцинирующего эффекта штамма Xss в растениях картофеля сорта Гатчинский.

В варианте 3 на 100 исследованных растений, зараженных вначале атаммом Хеь, а затем на седьмой день — массированно па- тогенным штаммом, выявляют только 9 растений с симптомами крапчатой мозаики, остальные оставались бессимптомными.

Следовательно, вакцинирующий эффект штамма Xgs равен 91 $, Штамм Хвв обладает длительным вакцинирующим эффектом. Растения картофеля, зараженные этим штаммом, в течение всего вегетационного периода остаются бессимптомными. Бессимптомными остаются также растения картофеля, содержащие штамм

Xss, и в шестой клубневой репродукции (время наблюдения).

Пример 6. Изучение влияния штамма

Хеь на урожай картофеля проводили на сорте Гатчинский в течение трех лет с 1984 по

1986 r.

Схема опыта.

Вариант 1 — контроль (здоровые растения).

Вариант 2 — растения, зараженные штаммом Хвв.

Вариант 3 — растения, зараженные сильнопатогенным штаммом ХВК.

B качестве исходного материала берут пробирочные меристемные растения сорта

Гатчинский, которые в количестве 75 штук были высажены в трехлитровые вазоны в. январе 1984 г. в условиях теплицы.

По 25 растений в фазе трех-пяти листьев заражали (08,02.84) слабопатогенным штаммом Хг.. и сильнопатогенным штаммом ХВК, 25 растений были оставлены в качестве контроля, Способ заражения штаммами ХВК состоял в однократном опрыскивании растений картофеля разбавленными вирусными суспензиями с карборундом с помощью ранцевого опрыскивателя при давлении

3,5 атм на расстоянии 10 — 15 см от поверхности листьев.

В течение трех месяцев проводили наблюдение за ростом и развитием растений, Растения, зараженные Xm, оставались бес-. симптомными, а на растениях картофеля, зараженных сильнопатогенным штаммом

ХВК, проявилась ярко выраженная мозаика.

Серологические анализы показали наличие

ХВ К во всех зараженных растениях, В конце апреля 1984 г. клубни от меристемных растений собирали и обрабатывали стимуляторами для прерывания периода покоя с целью использования их в полевом опыте по изучению влияния последействия штаммов

ХВК на урожай картофеля в 1984 r, В опыте 1984 г, использовали 206 проросших после стимуляции меристемных клубней, из них здоровыми (контроль) были

61 клубень; со штаммом Х6 — 73 клубня; с сильнопатогенным штаммом — 72 клубня.

Клубни высаживали для размножения на опытный участок в условиях тщательной изоляции, В течение вегетационного периода проводили наблюдение за ростом и развитием опытных растений, учет симптомов на них и серологический анализ на наличие вирусов.

Такие наблюдения и учеты проводили также в дальнейшем при выращивании картофеля в последующие годы, При выращивании растений картофеля в полевых условиях в 1984 г. отмечали, что растения, содержащие штамм X6g, оставались бессимптомными, а растения, содержащие сильнопатогенный штамм ХВК, были с симптомами ярко выраженной мозаики и отставали в росте и развитии. В итоге получали первую полевук> клубневую репродукцию, учет урожая которой был проведен по клонам.

Результаты опыта приведены в табл.4, Как видно из данных таблицы, вес клонов от растений, содержащих штамм Х6 на

7,9% больше веса клонов в контроле(здоровые растения). Сильнопатогенный штамм

ХВК снизил вес клонов на 41,7%. Получен- ые клубни были испсльзованы для закладки опыта в 1985 r.

Для получения данных последействия второго года 609 клубней первой полевой клубневой репродукции высаживали на опытный участок, в том числе в контроле — 178 клубней, содержащих штамм

Xrg — 315 клубней и содержащих сильнопатогенный штамм XBK — 116 клубней

Установлено, что растения, содержащие штамм Хб,оставались бессимптомными, а растения с сильнопатогенным штаммом ХВК вЂ” с симптомами ярко выраженной крапчатой мозаики, Учет урожая показал превышение веса клонов со штаммом

Хвв на 11,7% по сравнению с контролем, тогда как сильнопатогенный штамм ХВК снизил урожай клонов на 50.4%. Полученные клубни были использованы для закладки опыта в 1986 r.

Затем для получения данных последействия штаммов ХВК третьего года использовали клубни второй полевой клубневой репродукции. Всего использовано 600 клубней, по 200 клубней в каждом варианте.

Опыт проводили в четырехкратной повторности на двухрядковых делянках по 25 растений в рядке. Схема посадки 70х35 см, Наблюдения и учет те же, что и в прошлые годы, Установлено, что штамм Х6 не влияет на рост и развитие растений картофеля, не вызывает на них симптомов заболевания, тогда как сил ьнопатогенный штамм ХВК вызывает ярко выраженную крапчатую мозаику, растения отстают в росте и развитии.

При учете урожая установлено, что вес клонов со штаммом Xgg больше на 14,5% по сравнению с контролем. Сильнопатогенный штамм ХВК снижает вес клонов на 31,7%.

Пример 7, Повышение урожая картофеля, зараженного штаммом Хвв, отмечали в опыте на растениях картофеля сорта Гатчинский, где в качестве исходного материала брали меристемные клубни, полученные в полевых условиях, Опыт проводили в соответствии со схемой, изложенной в примере 6. Проводили такие же наблюдения и учеты.

В табл,4 показано влияние штаммов

ХВК на урожай картофеля сорта Гатчинский, При учете урожая картофеля установлено, что вес клонов растений, зараженных штаммом Хы, больше на 20,4% по сравнению с контролем. Сильнопатогенный штамм

ХВК снижает вес клонов на 46.5% (табл.4).

Таким образом, установлено, что штамм

Xgq не оказывает отрицательного влияния на урожай картофеля сорта Гатчинский в течение трех лет (время наблюдения), а наоборот, четко проявляется тенденция сти1687609

Таблица

Картофель

Контроль (здоровые растения) 56,0

69,3

Растения, зараяенные штаммом Х45

58, 7 +3,7 +6,6

+1,7

70,5

+1,ã

Растения, зараженные сильнопатогенным штаммом ХВК

-20,8

48,5

Дурман

Контроль (здоровые растения) 40,5

34,7

Растения, зараяенные а oи Х6

35,2

40,5

+0,5

Растения, зараженные сильнопатогенным штаммом XBK

30,2

-4,5 муля ции урожая на 7,9 — 20,4 по сравнению с контролем (здоровыми растениями).

Пример 8, Сравнительное испытание свойств штаммов ХВК проводили в 1989 году на меристемных растениях картофеля пробирочной культуры сорта Невский в теплице в зимне-весенний период и в полевых условиях, Схема опыта.

Вариант 1 — контроль (здоровые, без заражения, растения картофеля).

Вариант 2 — растения картофеля, зараженные штаммом ХВК Х66.

Вариант 3 — растения картофеля, зараженные штаммом ХВК Ху.

В каждом варианте использовали инфекционный сок растений дурмана Datuia

stramor1ium L., зараженных штаммом ХВК

Х65 или Ху. ЗаРажение Растений пРовоДили механически с помощью карборунда, В течение вегетационного периода проводили наблюдения за ростом и развитием растений, учет симптомов, серологический анализ на наличие вирусов картофеля.

Выявлено, что штамм ХВК Х65 ВНИИЗР

N 7 не вызывает симптомов заболевания на растениях картофеля, не влияет на их рост и развитие как в вегетационном. так и в полевых опытах.

Данные учета урожая показывают, что урожай картофеля, зараженного штаммом

5 Х65, в сравнении с контрольными растениями выше в вегетационном опыте на 22,5 и в полевом на 20,4 )ь. Урожай картофеля, содержащего штамм Ху, выше урожая с .контролем в вегетационном опыте на 6,3 и в

10 полевом опыте на 7,5.7ь (табл.5).

В табл.5 показано влияние штаммов

ХВК Х65 и Ху на урожай картофеля сорта

Невский (в опыте использованы меристемные растения пробирочной культуры).

15 Таким образом, сравнительное изучение штаммов ХВК Х85 и Ху показывает, что урожай картофеля, зараженного штаммом

Х65, выше урожая картофеля, содержащего штамм Ху, в вегетационном опыте на 16,2 7ь

20 и в полевом опыте на 12,9)ь.

Следовательно, штамм ХВ К Х88 обладает более высокими вакцинными свойствами, чем штамм Ху.

25 Формула изобретения

Штамм Х-вируса картофеля Xas ВНИИЗР

М 7 для вакцинации растений картофеля.

-30,0 34,6 -21,4 -38,2

-13,0 35,6 =.4,7 -12, 1

1бГЮОВ

Таблица 2 ант ые раст енные ш женные

3К ые раст енные ш

<енные

3К

Таблица 3

Вариант ль(незараженные ра ия, зараженные шт

35 ия, зараженные шт

; и на седьмой день с генным штаммом ХВ ия, зараженные сил чным штаммом XBK!

687609

Т я б л и ц я 4

Вариант гяс нб ь

f984 гол (первая клубневая репродукция) Контроль (здоровые растения) 61

161, 5

Растения, эаравенные тэ» Х

Растения, зарявенные сильнопатогенпым втаммом ХВК

174,5 е12,8

+7,9

94,2

-67,3

41 7

f985 год (вторая клубневая репродукция) Контроль (элоровыс растения) 178

1270

Растения, эаралснные итаммом Х 315 1 4 18 +148

+11,7

Растения, зяраяенные сипьнопатогенным итаммом XBf(116 630

-640

-50,4

1985 год (третья клубневая репродукция) Контроль (эдоровые растения) 73

1093

Растения, заряяен ые птвммом Х

Растения, эараяенные снльнопатогенным втаммон XBK

1316 +223

+20,4

585 -508

-46, 5

1986 год (третья клубневая репродукция) Контроль (здоровые растения) 200

1276

Растения ° зараиенные втаммом

Растения, звраяенные сильнопатогенным ютаммом XBK

200

1461

+f85

+!4,5

872

-91>7

1f

Выли выселены меристемные клубни, полученные в теплица цэ пробирочньк меристемньес растений.

Таблица 5

Резни а в кон оле

Урожайность (среднее значение), г/клон

Вариант г/клон

Вегетационный опыт

Контроль — здоровые (без заражения) растения

Растения, зараженные штаммом Xgg

Растения, зараженные штаммом Ху

Полевой опыт

Контроль — здоровые (без заражения) растения

Растения, зараженные штаммом Хец

Растения, за аженные штаммом Х

98

+18

+5.

+22,5

+6,3

201

242

2 1 6

+41

+15

+20,4

+7,5

Редактор М. Петрова Техред М.Моргентал

Корректор (Т. Палий

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3678 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5