Способ отбора бактериального фага для приготовления лечебно- профилактических препаратов

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам отбора бактериофагов для лечебно-профилактических препаратов. Целью изобретения является повышение точности и упрощения процедуры отбора фагов. Отбор фагов проводят из числа лизоцимпродуцирующих. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s А 61 К 39/12, С 12 и 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4483827/13 (22) 10.06.88 (46) 23.07,91. Бюл. М 27 (71) Оренбургский государственный медицинский институт и Горьковский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) О.В. Бухарин, Т.А. Аникина, Д.Г. Дерябин, Ю.Б. Николаева и О,Л: Чернова (53) 576.858.9(088.8) Изобретение относится к медицине, а именно к способам отбора бактериофагов.

Целью изобретения является повышение точности и упрощение процедуры отбора фагов.

Пример 1. Формируют 2 пула фагов, лизоцим продуцирующих и лиэоцим не продуци рующих.

Для отбора фагов продуцирующих лизоцим на строго горизонтальной поверхности в чашки Петри разливают по 10 — 15 мл 1,5 ного мясопептонного агара и затем чашки подсушивают при 37 С в течение 1-1,5 ч.

Затем на поверхность 1,5 -ного агара наносят второй слой, состоящий из 2 мл 0,7 ного мясопептонного arapa, 0,2 мл бульонной культуры индикаторной бактерии, подращенной на 27;-ном мясопептонном бульоне в течение 2-2,5 ч до лаг-фазы и

0,1 мл испытуемого фага. оттитрованного так, что в 1 мл содержится 102-10 БОЕ (т.е. в верхний слой агара вйосится 10 — 10 БОЕ).

После застывания верхнего слоя агара чашки инкубируют при 37 С в течение 10-12 ч, после чего на поверхность газона культуры с образованными на ней стерильными пятнами наслаивают 10 — 15 мл хлороформа на

10 мин. После того как хлороформ сливают, ... Я2,Ä 1664327 А1 (54) СПОСОБ ОТБОРА БАКТЕРИАЛЬНОГО

ФАГА. ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛЕЧЕБНОПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к способам отбора бактериофагов для лечебно-профилактических препаратов, Целью изобретения является повышение точности и упрощения процедуры отбора фагов. Отбор фагов проводят иэ числа лизоцимпродуцирующих. 3 табл, чашки помещают в термостате (37 С) и учитывают лиэоцим-продукцию по образова- © нию ареолов полулиэиса вокруг бляшек через 1 и 12 ч (для энетробактерий) через 12 и 24 ч (для стафилококков), При изучении чувствительности золотистых стафилококков к 23 бактериофагам международного набора, у ряда которых обнаружена или не обнаружена продукция лизоцимподобного фермента, установлено, . О что фаги, не продуцирующие лизоцим, имеют более узкий литический спектр по срав- 0 нению с лизоцимпродуцирующими фагами Фь (табл. 1). Так лизоцим-непродуцирующие (фд фаги обладают почти в два раза более узким Я спектром литического действия по сравнению с лизоцимпродуцирующими фагами. (32,37ь лизабельных культур против 62,37 соответственно). При этом сужение литического спектра фагов, не продуцирующих ли° ВВИВ зоцим, в основном обусловлено их неспособностью вызывать лизис культур, обладающих антилизоцимной активностью (только 11,47; лизабельных культур), в то время как лизоцимпродуцирующие фаги оказываются способными преодолевать

"антилизоцимную защиту" бактерий и вызывать их лизис в 56,87 случаев.

1664327

Таблица 1

Литический спектр стафилококковых бактериофагов продуцирующих и не продуцирующих лиэоцимподобные ферменты в отношении АЛА и

АЛА золотистых стафилококков

Продолжение табл.1

Из них стафилококки без антилизоцимной активности, абс.

Характе Из них стафилококки с антилиэоцимной активностью, абс. 7ь ристика стафилофагов

Всего Лизабельны

Устойчивы

Лиэабельны Устойчивы

Лизоцимнепро- 5 дуцирующие 11,4 + 4,8

Лизоцим про- 25 д и ющие 56,8 7,4

70

88,6 = 4,8

43,2 +.7,4

59,8 4,5

40,2 + 4,5

117

64,9 +4,4

35,1 + 4,4

117

При репродукции дизентерийных фагов с различным уровнем лизоцимпродукции на изогенных штаммах шигелл Флекснера, отличающихся по уровню антилизоцимной активности происходит нарушение нор- 5 мального размножения фага, не продуцирующего лизоцимаподобного фермента, на штамме с высоким уровнем АЛА (табл. 2), что выражается в замедлении лизиса инфицированной бактерии изнутри: удлинении 10 латентного периода развития фага и периода выхода зрелых фаговых частиц; в результате чего и урожай фага к 60-й минуте инфицирования оказывается сниженным, В то время дизентерийный бактериофаг с вы- 15 соким уровнем лизоцимпродукции эффективно преодолевает антилизоцимную защиту бактерии — параметры его репродук-. ции на штаммах с высоким и низким уровнем АЛА существенно не отличаются. 20

При проведении первичного отбора фагов по признаку лизоцимпродукции отбираются фаги с наиболее широким спектром действия (диапазон индекса чувствительности культур к отобранным лизоцимпродуци- 25 рующим. фа гам 0,61-0,92 против 0,.18-0,92), чем достигается сокращение группы фвгов для дальнейшего углублейного исследования по известному способу (от 50 до 22) соответственно. 30

Пример 2. Оценивают медицинскую эффективность стафилококковых фагов (на мазевой основе), один из которых продуцирует значительные количества лиэоцимоподобного фермента, а другой не проявляет способности к лизоцимпродукции, Бактериофаги применяют для санации стафилококковых бактерионосителей путем закладывания стафилофаговой мази в носовые ходы 1 раз в сутки в течение 5 — 6 дней, Иэ данных, приведенных в табл. 3, видно, что санация лизоцимпродуцирующим фагом позволяет достичь наиболее выраженного эффекта в 51,9)(, случаев по сравнению с 35,07, при санации нелизоцимпродуцирующим фагом.

Таким образом, отбор бактериофага по предлагаемому способу позволяет повысить эффективность создаваемых на основе бактериофагов лечебно-профилактических препаратов.

Формула изобретения

Способ отбора бактериального фага для приготовления лечебно-профилактических препаратов, включающий выделение фага и получение фаголизата, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, фаголизат высевают на плотную питательную среду, содержащую фагочувствительные бактерии, не проявляющие антилизоцимной активности, посевы инкубируют, обрабатывают хлороформом и отбирают фаги, образующие стерильные пятна с ареолом вторичного лизиса.

1664327

Таблица 2

Параметры одиночного цикла развития лизоцимпродуцирующего и нелизоцимпродуцирующего фагов на изогенных штаммах шигеллФлекснера, отличающихся по уровню антилизоцимной активности (АЛА) Длительность латентного периода, мин

Длительность периода выхода, мин

Фаги.516 (8 мкг)

516-1 (2 мкг) 6,0 «4 0,12

58 й.0 11

101,2 4,1

104,7 + 4,6

20,4

20,4

9,3

9,3

516 (8 мкг)

516-1 (2 мкг) 34,8*

27,3

29,3*

20,7

7,6 4- 0,06*

10,6 - 0,08

3,1 + 0,44

2,9 ": 0,03

* — Р<0,05

Таблица 3

Эффективность применения лизоцимпродуцирующих и лизоцимнепродуцирующих бактериофагов для санации стафилококковых бактерионосителей

Составитель О.Жакетов

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М,Кучерявая

Редактор Н.Рогулич

Заказ 2341 Тираж 458 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

F4/В (лизоцимпродуцирующий) н

F 66/В (лизоцимнепродуцирующий) Номер штамма шигелл

Флекснера и их АЛА

Константа скорости адсорбции фага х

10 мл/мин

X+m

Средний урожай фаза на

1 клетку(к

60-й минуте инфицирования X + m