Способ определения токсического воздействия химических веществ, содержащихся в водной среде, на культуру планктонных гидробионтов

 

Изобретение относится к водной токсикологии и может быть использовано для биологического контроля качества сточных вод и вод в водоемах. Целью изобретения является повышение точности оценки за счет определения уровней токсического воздействия исследуемого вещества и сокращения расхода исследуемой среды и культуры гидробионтов. Методом корреляционнодоплеровской спектроскопии оценивают величину энергозатрат планкто нных гидробионтов на движение в период температурного скачка среды их содер - жания с 22 до 28°С. Строят график зависимости величины энергозатрат от концентрации исследуемого вещества в исследуемой среде. Нижнюю границу токсического действия исследуемого вещества определяют по первому пику вес личины энергозатрат гидробионтов на движение, а по второму пику - максимально допустимую концентрацию исследуемого вещества. 1 з.п. Л-лы, 7 ил., 1 табл,, (Л

С(МОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (5g)5 С 01 N 33/18

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ и ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Н А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4342604/13 (22) 11. 12. 87 (46) 30. 10. 91. Бюл, P 40 (71) Украинский. научно-исследовательский институт по племенному делу в животноводстве (72) Л.Л. Бегма, В.В. Власенко, Ф.М. Пеньков, A.Ã. Паничев и В.И. Мацкивский (53) 586(088.8) (56) Лвторское свидетельство СССР

Н 1482887, кл, Г 01 N 33/18, 1987., (54) СПОСОБ ОПРЕПЕЛЕРИЯ ТОКСИЧЕСКОГО

ВОЗДЕЙСТВИЯ Х1ПЧИ ЕСКИХ RFPECTB, СОДЕРБЛЩИХСЯ В ВОДНОЙ CPFJIEpHA КУЛЬТУРУ

ПЛЛНК" ОНННХ ГИДРОБИОНТОВ (57) Изобретение относится к водной токсикологии и может быть использовано для биологического контроля качества сточных вод и вод в водоемах.

Изобретение относится к водной токсикологии и может быть использовано для биологического контроля за токсичнымп водорастворимыми веществами с использованием в качестве тест-объекта простейших в системе мониторинга и контроля качества воды, в том числе при сбросе сточных вод промышленных предприятий, поверхностного c îêa при мелиорации и других областях, где требуется оперативный контроль качества воднОй среды.

Проблема -биотестирования является одной из важных в области охраны природы, в частности при контроле хими„„SU„„1688161 A 1

Целью изобретения является повышение точности оценки за счет определения уровней токсического воздействия исследуемого вещества и сокращения расхода исследуемой среды и культуры гидробионтов, Методом корреляционнодоплеровской спектроскопии оценивают величину энергозатрат планктонных гидробионтов на движение в период температурного скачка среды их содер" жания с 22 до 28 С. Строят график зависимости величины энергозатрат от концентрации исследуемого вещества в исследуемой среде. Нижнюю границу токсического действия исследуемого вещества определяют по первому пику ве- а личины энергозатрат гидробионтов на движение, а по второму пику — максимально допустимую концентрацию исследуемого вещества. i з.п. *-лы, 7 ил., С, 1 табл. ческого загрязнения водной среды. При этом особую актуальность принимают все методы оперативного контроля, т.е. методы оценки физиологического состояния биологических тест-объектов в краткосрочных опытах. Учитывая большую информативность оценок пс подвижности микроорганизмов, последние находят большое развитие для задач биотестирования.

Известен способ определения средней скорости движения совокупности однородных биологических объектов, согласно которому регистрируют следы

1688161

3) тзтl)г(с ((I! я и 3 о C)pлжс. lтт(i! г! (! 1»тlslе О (кpс(н Р ., т<ртl этом скоростт. тзы (ислтпот по Ас»рыу. (е

v = (--. — 1) 1о/;-,,") ( с г. 5 о где !) — Суымлргтяя пл )(ггя,г(г изобрлжеНийl CJleJ(ol» Т,)ЕКО»3 времени о !

) — суммарная плон(лдь изобрлже-!

НИй СЛЕДОВ ТВЕКС(Н В МОМЕНТ времени

Р

t = t — t р — хлрлктерняя длина сетки экрана.

Данный способ являетсs; усовер(тген-С,тВОВЛНИЕМ ИЗВЕСтнотге МЕт()Па РЕГИСТ1О рации скорости движения микроорганизМов в воде. Однако,(IJ(ÿ обоих этих способов характерна болтяляя ошибка

Измерения, которая связана клк со значительной систематической ошибкой (опыты ведут с пом(эг!(ьто и! гкроскопл), тяк и с субъективизмсм оценки, так как оператор на экране нлблюдлет лишь движения в одной плос:(ости. При этсм

11 все вращательные движения, кувыркатгиЯ дВижРHHß R перл(зндитсулЯрнОЙ плоскости на тзтздео.экр,!!те не отрлжаютс .я, Очевид!го, что вкляд этих движений в суммярнуго скорость можс.т быть (ущественным. Кроме того, явления фОтОТЛКСИСа НаКЛЛДтллаит ДОПОг(вттТЕЛЬные эЬ(т)ектьт, которые практически учесть тзевоэт.ожно. . акого типа ошиб35 кн присущи Всем методам контроля под- . вижности с помоггью мl :кроскОпнОГО наб людения,. Кроме того, при движении клеток в поп гпяции обычно наблюдается с,ледующий эд)(т)ект. Под зижные клетки п)и

Своем движении вовлекают В поток неПОДВИЖНЫЕ ИЛИ МЕРТ ЯГ ГР ТОЧКИ, KOTOPÜK с)ператор принимает зл поцвижные, что

3,"àêæå вносит большую ошибку в измереНия, особенно при гталичии пристеночных

Явлений. Последнее ст»язлтго с ограничеНием рабочего объема покрьпзным стеклом.

Разделение подг(тжн! тх тт неподвижтт) тх клеток в популяции — это сложная задача, которую, например, решают путем фрлкционирования с псмощью специальных сефадексколонок.

Кроме того, в анализах сОстОяния популяции зтвижущихся клеток обычно

55 измеряют только скорс сть движения, гак клк неподг»ижные к:IpTKH Hp всегдя отражают иертвОР. состояние. Организм»,! могут на некоторое время останов!»тьст, ;l (л тpм (.т! о па начит! (»(От дг»иl лтг>ся, !10— этому эадячя идентификации неподвижных клеток — это проблема, котс)руго необходттмо решить при анализе состояния попуттяцитз дтзижущихся . (икрос рганизмов.

При опенке токсического воэ,пействия химических веществ на движущис.ся биологи»тест(ие тест-объекты все недостатки, присул(не Визулпьной микроскопии, не позволяют обеспе(ить высокую точНос TI и г(остоверттость янллиза, так как ошибка оператора в измерении истинной скорости дг»ижетгия и ттроцента подви)т(ных клеток обычно достигает,пля подвижности ня малых скоростях 10-207. в сторояу увеличения результатотз измерениг(, л на бо(ьших — до 307.. в сторотту зстнттженттт(результатов °

Известен способ оценки токсичности с использованием простейших, согласно

KoTopoI тпксическое,пействие в экспериметттах оцени!злется по интенсивнос— ти роста и поттвттжгзосттт, опреттеляемой поп микроскопом„ При этом степень ингибировлттия оценивяк)т в процентах за опредепе!Пптй и(рио(т Времени путем построения пробит-графика и определения 50 ! лтгному способу присущи все Вьллеперечисленные недостатки, к которым добавляются еще )(лителт г!Ость анализа до 12 ч и отсутствие учета влияния температурных э(т)фектов и пиркадных ритмов футгкционировяния организмов.

Известен способ определения токсичности водорастворимых веществ, согласHO которому токси (íîс TH l»å((pств опт)РДРляют путем О!те!(KИ ттx Влияния на двигателытук) активность тзнфузории

Те ага!)ушРП л ру r i f o rm is путем дис пергирования инфузорий в культ ральной среде и регистрации изменения величины светопропускания "сультуры до и после экспозит(тстт с исследуемьгм вещес гвои, При этом культуру Телега!)ушега

Р>irifoxmis культивируют нл аминопептидной сре,гге (0,67.-ный раствор аминопетттидл и 0,27 ный раствор дрожжевого экстракта) при 2?оО и содержащую в

1 мл J(0-60 тыс. особей помещлтот в кювету с расстоянием между рабочими гранями 20 мл. Кювету устанлвливлют в прлвьл! кюветодержатель колориметраттес)елоыетра (ьЗК-568 с освещением светом длиной волны (3 = 582 мм), В левый кк)ветодержлтель устанавливают кюв»ету- с аминопепгиднзэй средой .

16881

Ин узории перемешинанием диспсргируют в кювете (контроль) и, вращая левьи" барабан не*елометра, в течение

3 мин после прекращения перемешивания поддерживают стрелку измерительного

5 грибора на "0", регистрируя каждые

10 с значения на шкале светопропускания вращаемого барабана °

Затем (опь|т) в кювету вводят испытуемое вещество заданной концентрации и аналогично проводят измерения так, как и в контроле.

Двигательную активность инфузорий определяют по сумме разниц (Ь. между 15 соседними значениями светопропускания с последующим вычислением относительного измерения в процентах /Р,„/-zj „.,/ -/О конт l

При этом графическим путем методом пробит-анализа определяют концентрацию I.Ñ, при которой двигательная активность уменьшается на 507..

К недостаткам данного способа относится следующее.

В сути известного способа лежит явление отрицательного фототаксиса инфузорий, при котором клетки уходят 30 из эоны наблюдения (сканирования световым пучком), а о токсическом действии судят по снижению двигательной активности„ Однако для фототаксиса присуща суточная ритмика, при этом токсический эффект будет иметь существенную зависимость от времени анализа в сутках, что обуславливает низкую точность оценки токсичности и воспроизводимость анализа. 40 низкая точность определения токсичности связана также и с тем, что данному способу присуща большая динамическая ошибка в проведении опыта, которая связана с изменением скорости 45 ухода клеток из зоны наблюдения в зависимости от седиментационных и коагуляционных характеристик культуры.

0 невидно, этот показатель может изменяться от физико-химических свойств 50 испытываемьгх веществ, особенно от сложного их комплекса, например, сточных вод. Этот факт в известном способе практически не поддается учету.

Измеряемый признак не отражает 55 физиологической характеристики движения отдельных клеток, что не позволяет корректно оценивать биологическую реакцию тест-объекта (инфузорий), так как с помощью нефелометра ro сути измеряется конпентрация клеток в зоне наблюдения„ При действии токсиканта могут развиваться реакции разрушения клеток (что ведет к увели нению концентрации микроагрегRToR в суспензии), стресса. которые развиваются в сторону уменьшения параметрической чуBCTBHTeJIhHocTH, в частности, к фототаксисе (что ведет также к увеличению концентрации клеток в зor-;е наблюдения) и т„п, Кроме того, измерение мопуля изменения параметра контроля вносит дополнительную ошибку в процесс оценки фототаксиса, TBK как при этом учитываются нсе изменения концентрации клеток, которые связаны с перемешиванием, флотацией, седиментацией и,пругими процессами не физиологической природы для тест-о6>ектов.

Следовательно, данному способу присуща низкая достоверность определения токсичности химических веществ,, Большой объем камеры (порядка

10 см ) требует с учетом испытания как минимум пяти-шести концентраций вещества и трех повторностей как минимум

150 мл культуральной среды. Испытываемые вещества могут быть различной ценности (впервые полученные или препаративно выделенные, каK правило, очень дорогие), поэтому данный способ. очень

«eэкономичен.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения токсического воздействия химических веществ, содержащихся в водной среде, на культуру планктонных гидробионтов — микровадорослей.

Данный способ предусматривает культивирование водорослей в опытных и контрольнь;х камерах, введение в опытные камеры исследуемой среды, выдерживание водорослей в присутствии исследуемой срепы, измерение в этот период времени средней скорости движения по ансамблю клеток водорослей в опыте и контроле методом корреляционно-лоплеровской спектроскопии, оценку отношения числа подвижных клеток в культуре и числу неподвижных соответственно в опыте и контроле, оценку по полученным данным величины энергозатрат гидробионтов на движение и суждение о токсическом воздействии исследуемой среды по величине энергозатрат на движение в опыте, 1б881б1

К педосTBTKBM этого способа мож>н> отнести невысокую то-.:ность оценки ввиду невозможности с пределения уровней токсического ноз;",с 1cтвия, большой

5 расход исследуемой средь: и культуры

JI O J.I,O » O O J1P É .

Пелью изобретения является Г(ов>п>>ение точности оценки,а счет определения урон токсичесГ;огс воздействия исследуемого Вещества и сокращение расхода исследуемой (.реу;ь(и культуры гкдробионтов.

Способ осуществляют следу>ощим об.разом. 15

Через 30-60 мин п(>сле начала инк> "бации среду с гидробионтами подвергают фиксированному воздействию в в л, я. де температурного ск 1 Ilc-.>. с 22 до 28 С облучают когерентпым светом с длиной волны в красном диапазон(. ., например, 632,8 нм с кзме1рением (1>луктуацлй рассеянного движущимися клетками света и оценивают .скорость и число

25 подвижных клеток, а относительную величину энергозатрат на движение клеток в популяции гычисляют по формуле

30 где "о„, 1 — средняя (.корость по ансамбли клеток микроорга>лизмов в зоне наблюдения соответстпенно в опыте и контроле,. мкг/с;

1„;. —

„ >,? — отношение числа подвижОя ных клеток В популяции к числу неподвижl(ъ|х соответс гвенно в опыте

И К>- 11т РОЛЕ > OTH > PД» ф

О((>,С- (o)<- значение корреляционной (lII (1>ункIIHH при времени задержки, равном нулю, 45 соответственно в опьте и контроле, усл,ед., при этом нижню>о границу токсического действия вещества ог:ределяют по первому пику параметри (еск(>й чувствитель-5О ности энергозатрат::-:;а движение клетск в популяции, а максимально допустиму(о концентрацию химического вещества - по второму пику параметрической чувствительности. 55

Проведение инкубяции биологического тест-объекта с химическим веще— ством в течение >О-!,О мкн обеспечив-!ет реа>гизацкю кратк Г>срсчного опыте.

КОНТРОЛЯ ХИМИЧЕСКОГО ROÇ JI e>I (: T I>H Ë ПРИ

RIIRJIHз e TOY "-и 1 11 О(- 1 И 9 т .- опера I HB ност1. анализа. .«>а зто время организмы тест-объекта изменя>от только энергетические характеристики своего состояния, а параметры, отражающие >п(формационные потоки (в генетк (еском аппарате и др, ), Г(е усГ>енают отреагирс— вать. Треб>онан(>я на длитель1>ость повреждающего воздействия В этом аспекте

11ожно Г!редстатЗить Г> OJIc д > ищем 1>идс .

t Лоп(-С -(1о,, 1 где t o — длительность опыта; — характерное врс(лл развития

ОPI полного цикла жизнедеятельности тест=объекта (,пля инфузорий это Время составляет >- I) ограничение обеспечивает точности и ВоспроизводимосДанное повышение ти анализа, так как позволяет исключить влияние не только медленных циклов жизпеде> тельности организма в реаКЦИИ На ХИМИЧЕСКОС ВОЗПЕПСтВИЕ, НО И суточных ритмов параметров рви>1(ения инфузорий, При лл>лтельностях, сравнимых или больших характерных времени, необходимо обязательно учитывать все параметры жизнедеятельности микроорганизмов, а это на практике обычно

ocyIlIecTIIHTJ очень слож.го, так как требуется проведение хронических опытов с привлечением помимо всего прочего и Лурье-анализа временных рядов данных. ( Щ

= 2 Р; 1- B, -, J где Р,,Р, ...Р„„ — . ероятности событий 1,?, „,I.>

То, что после ннкубации суспензию микроорганизмов подгзерга>от фиксированному воздейств1л>о в ниде температурного скачка заданной величины, обеспечивает Высокую точность оценки реакции живых организмов на токсическое воздействие, так как Г(ри этом изучается параметрическая чувствительность (в данном случае термочувствительность), прк которой извлекается наибольшее количество информации о состоянии тестобъекта., ля расчета и11(1>ормации в случае Hpравномерностых событий Леноном предложено уравнение энтропии кнформации

1688161

Предлпжим > что очно из собь1тий дос товерно, т.е. вероятность его равна ! единице. В этом случае имеем

-(log<1 + О+ ... + О) = О т.е.

5 система не содержит никакой неопределенности и сообщение о ее испытании. не содержит никакой информации (при отсутствии температурного скачка состояние тест-объекта не изменяется в опыте), так как i = -О lov,<0 = О.

Наибольшее количество ин*ормации несут равновероятные события (при температурном скачке в популяции все клетки адекватно реагиРуют на температурное воздействие), т.е. когда

Р< = 1/2, поскольку i = †(1/2 log<1/2 +

+ 1/2 lop g 1/?)

Вот почему прием температурного скачка, при котором не происходят не- 20 обратимые сдвиги в клетках, является наиболее эффективным методом оценки реакции популяции клеток на воздействие, в частности, токсикантом.

Облучение когерентным светом с длиной волны в красном диапазоне, например, 63?,8 нм обеспечивает повышение точности оценки скорости движения клеток микроорганизмов (инфузорий) методом доплеровской спектроскопии.

Измерение флуктуации рассеянного движущимися клетками света обеспечивает измерение скорости движения микроорганизмов методом доплеровской спектроскопии при низких требованиях

35 к стабильности параметров как источника излучения, так и измерительного тракта. Для этого достаточно, чтобы характерные времена изменения параметров системы были не соизмеримы с характерными временами доплеровского сдвига на микроорганизмах.

Таким образом, прием измерения корреляционной функции при гоплеров-. ской спектроскопии в целом повышает 45 точность оценки состояния биологического тест-объекта.

То, что из корреляционной функции получают скорость и долю подвижных клеток, обеспечивает объективный ана- 50 лиз состояния популяции подвижных клеток. Корреляционная функция имеет быстро- и медленноспадающие компоненты. Параметры быстроспадающего слагаемого связаны с величиной средней

55 по ансамблю скорости двикения микроорганизмов, а относительный вес медленноспадающего компонента определяет относительное количество неподвижных клеток. Эти параметры движения извлекаются, например, путем подгонки по методу наименьших квадратов.

Таким образом, при анализе состояния популяции микроорганизмов методом корреляционно-доплеровской спектроскопии в условиях автоматизации съема и обработки информации о скорости и подвижности клеток исключается субъективизм оценки, причем величину погрешности можно уменьшить путем увеличения объема выборки (количества экспериментов). Реальное время съема и обсчета информации в одном опыте составляет 1,5 — 2,0 мин.

То, что при анализе состояния популяции подвижных микроорганизмов используется показатель в виде v gC(o) обеспечивает оценку энергозатрат на движение клеток и энергия, расходуемая на трение, пропорциональна ч, а f,:(o) пропорциональна количеству движущихся клеток в зоне наблюдения, так как P — это подвижность, а

G(o) — пропорциональна числу клеток в момент съема информации в зоне наблюдения. Последний параметр по сути учитывает процесс изменения концентрации клеток в зоне съема, которая може-. быть связана с процессом фототаксиса, гибели клеток с осаждением их и др. Следует отметить, что ранее в исследованиях при анализе показателей движения, например, инфузорий, нигде этот признак не использовался.

Величина энергозатрат отражает свойство популяции энергообъема с внешней средой, и в этом проявляется фундаментальность оценки биосистемы, по данному признаку. Зто связано с тем. что в популяции подвижных микроорганизмов функция. движения клетки является результирующим проявлением жизненно важных процессов ° Так, известно, что трофические реакции, изменения таксического характера (фототаксис, хемотаксис, термотаксис и т.д,) и даже функции размножения популяции имеют непосредственную связь с показателями движения клетки. В этом проявляется фундаментальность оценки состояния популяции подвижных микроорганизмов по изменению средних по популяции параметров движения. То, что в качестве основного критерия оценки взят параметр двигательных энергозатрат, связано с тем, что в этом пока16 8161

12 зателе. учитывается как относительное количество подвижных клеток в популяции, так ч средняя по ансамблю микрОорганизмов скорость перемещения„

5 т,е. в этом проявляется универсальность измеряемого параметра.

Исследования показывают„что именно показатель энергозатрат наиболее инФормативен по сравнению как с характе ристикой скорости, так и с подвижностью клеток, по крайней мере„ в опытах по исследованию термочувствительности„

В качестве примера целесообразно рассмотреть результаты (таблицу) экспериментов в которых изучалась реакция на температурный скачок в течение 5 мин с измерением скорости, под-вижности клеток и энергозатрат на 20 ,пвижение клеток через \,5 мин после начапа воздействия теггпературы (скачок от 22 до 28 С). Все результаты нормированы в виде fj, !. 1, где значение измеряемой с ;ункции; Y — сред-?5 нее значение по выборке иэ 7 oIIbITOII, Используя критерий информационной значимости испытываемого признака в

«иде ЗΠ—,7Р log Р

,1 имеем для скорости величину 0,985,для подвижности — 1,84, а для энергозатрат — 1,95. Из этогэ следует, что с 35

Гочки зрения информационной значимости показатель энергозатрат отражает

В большей степени переходный процесс популяции на температурный скачок, гем другие, gQ

Такигл образом, использование показателя энергозатрат при оценке токсического действия химических веществ

На популяцию движущихся клеток является принципиально новым признаком, который ранее в таком виде нигде не рассматривался.

То, что отиосительную величину энергозатрат на движение клеток в популяции вычисляют по формуле

, io G (o) о„

Г

v (1K G(0)К обеспечивает воспроиэводимость результатов оценки, так как при этом в относительном показаrелe энергозатрат учитываются возможные изменения физиологическсго состояния исходной культуры микроорганизмов, имеющие характерные изменения при развитии популяции в процессе их культивирования или в результате суточной динамики.функционирования организмов, при этом также повышается точность измерения,.

То, что нижнюю границу токсического действия вещества определяют по первому типу параметрической чувствитепьности энергозатрат на движение клеток в популяции, а максимально допустимую концентрацию химического вещества — по второму циклу параметрической чувствительности„ обеспечивает точность оценки токсического действия вещества в краткосрочных опытах. Это связано с тем, что характер реакции популяции движущихся организмов при действии повреждающего фактора (температурные и химические воздействия) изменяется в зависимости от интенсивности воздействия. При этом наблюдаются первая фаза стимуляции, которая проявляется увеличением параметрической чувствительности, фаза стресса с ми1 иимапьной чувствительностью к дейст-. вию внешнего фактора, после которой снова повышается (вторично) параметрическая чувствительность, причем эиергозатраты относительно увеличиваются. Однако, если на первой фазе снять воздействие, то биосистема возвращается в свое нормальное состояние, из стресса популяции также восстанавливает свои характеристики, а вот при наличии второй фазы увеличения термочувствительности энергозатрат снятие воздействия не сопровождается переходом биосистемы в норму.

Обычно наблюдали либо значительньгй гистерезис переходного процесса, либо последующую раскачку параметров популяции и ее деградацию (по крайней мере, при гех временах наблюдения, которые исследовались в опытах). Учитывая стохастичпость реакции тест-объекта (популяции) на токсическое воздействие, необходимо в исследованиях ие только контролировать средние па.рамет ры тест-объекта, ио и стохастические характеристики например вериабильность

Р которая отражает системные свойства объекта анализа. Установлено, что фазность реакции проявляется и в вариабильиости характеристик движения клеток в популяции. ";явный феномен

1680161 реакции биосистемы наблюдали и на других годвижных объектах (простейшие, микроводоросли, активный ил очистных сооружений, сперма).

Учет состояния исходной популяции микроорганизмов осуществляют по вариабильности отклика популяции на токсическое воздействие в зависимости от фазы роСта. Это обеспечивает установление наиболее оптимальных условий для проведения опытов, с точки зрения выбора фазы роста популяции. Вполне естественная ситуация, когда в опытах п II используют старую культуру, а в этом 5 случае и необходим критерий отбраковки культуры. Все это повышает воспроизводимость результатов, что особенно важно при сопоставлении токсикантов.

Величину температурного скачка 20 определяют по минимуму вариабильности температурного отклика популяции микроорганизмов, например для инфузорий

Tetrahymena pyriformis температурный скачок устанавливается в пределах от

22 до 28 С, Данный признак повьппает воспроизводимость реакции тест-объекта, обеспечивает принципиальную возможность измерения с высокой точностью парамет-30 рической чувствительности реакции подвижных организмов на токсикант, т.е. именно в этом температурном диапазоне происходит однонаправленное изменение энергозатрат ка движение клеток в по- пуляции, с минимальной вариабильностью в точке 20 С, На фиг. 1 представлена блок-схема устройства для измерения энергозатрат популяции на движения инфузорий в ре- 40 альном масштабе времени методом корреляционно-доплеровской спектроскопии; на фиг. 2 — температурные зависимости энергозатрат популяции ка движение инфузорий и вариабильности их ответа; 45 на фиг. 3 — динамика реакции популяций инфузорий на температурный скачок; на фиг, 4 — суточные изменения параметров движения инфузорий Т.pyriformis; на фиг. 5 — кинетика изменения энерго-50 затрат популяции на движение инфузорий при различной концентрации токсиканта; на фиг. 6 — дозовые зависимости реакции биологического тест-объекта на действие меди в краткосрочном опыте на различных стадиях развития популяции; на фиг. 7 — дозовые зависимости реакции инфузорий ка действие этилового спирта в краткосрочных опытах.

Устройство для реализации предлагаемого способа содержит источник 1 ко" геренткого излучения в диапазоне красного света, в качестве которого использован ЛГ-105 с источником 2 питания, На выходе лазера 1 установлены диафрагма 3 и линза 4. Излучение падает перпендикулярно на измерительную камеру 5, снабженную термостатирующей рубашкой, которая соединена с термостатом 6. Рассеянный свет от суспензии и блик от передней стенки кюветы регистрируются фотоприемником 7, в качестве которого использо" вак фотоэлектрическии умножитель

ФЭУ-79, установленный под углом 16о

20 и снабженный диафрагмой 8, которая реализует собой камеру обскура.

Питание ФЭУ осуществляют блоком 9 высоковольтного питания типа 85-24 или

ВС-22. Выход фотоприемника 7 соединен с входом усилителя 10 типа У 4-28, вь.ход которого соединен с входом коррелятора 1 1, типа Х6-4. Цифровой выход коррелятора 11 соединен с входом микроЭВМ 12 типа СМО-401. С микроЭВМ 12 идут сигкалы управления работой коррелятора 11, при этом интервалы между съемами информации задаются таймером 13. Выход микроЭВМ,2 соединен с цифропечатающим устройством 14 типа Искра 001-45.

1 ультуру простейших — инфузорий

Tetrahymena pyrifornis использовали в качестве тест-объекта„ Преимуществом этого организма является высокая чувствительность и возможность его выращивания в чистых средах без бактерий, в отличие от культур других простейших, для которых бактерии служат в качестве пищи.

После предварительного культивирования инфузорий на питательной среде составом, включающим, пептон 20 г, глюкозу — 5 н. NaC1 — 1 г, дрожжевой экстракт 1 мл, дистиллированную воду

1 л, при рН 7,1, которое осуществляют путем пересева на 5 мл среды 2 капли из 1 мл пипетки Мора суспензии клеток при температуре 21+2 С в течение времени, на которое популяция переходит в ту или иную фазу роста (экспонекциальную или стационарную), пробу микроорганизмов вводят в сосуд для инкубации, куда вводят химическое вещество с заданной концентрацией. Если исследуемая вода с токсикантом имеет неизвестный состав, что характерно

1FlH" 1F) 1

j тз

)ТЛя HC< Л(Jfn(<:1111Òß тонг!1 <((1<О Го Jf(. It<3ò иия lтлп!)име l) стоп;t>: I)<1, 1 < т() ГРТО вя f рял проб ттоттьт; . л,т 3ltff()lf крлти()— (;òI f<) рлзбав)тенин, 11(1!1;)им(!) 1: 1, 1: 2, 1.5, 1.10, 1.20, 1. )0 .:l00 I:200

I:т)00, 1: l000, 1: 10(l 001. ! 1111<убацт!ю i.y<3 ll(. и э в(3 o(у ttl(. o Tf)JIHfoT

13 условиях мягкого ре>!<13!та о вен!еииости так, чтобы !le ff()ff;3)Iaff прямой (олнеч!<ый свет 0(ти(!ко 3лт(.ми»lfH!1 нежелательно, тлк клк т, эт<)м случл» после облучения ллзериым светом ири и)мер(= виях 1троявлт!Ют(я ятз- !(-Иия фoтo тлксиса в больщей мере, ."ем при световом режиме инкублцпи. Температуру инкубации уста)тат<я)!Вл-от и пред(л 1>( от ?О до 2 С ттре(!почтителт,ио 21 С

У ,а со стабильностью +0,5 С. JIJfHTPJfiif toeòü

Ттикублции 1)ь161трлт<)т в п)(едеJt()x 30" 20 т)0 мии в зависимости от трсбо)заиий оперативного !

)те!< ст вил ток гик(llf ТН, После иикублции густ<е)тзтью ттикроОрглни..)мот) помещают,i%HJ . 1) в и.)мерl тт(-л ьную K

Пучок кот (..ретттиого св< та с дтпл!Ой волны, например, б32,8 им от л l lPJ)1 30 .11-105 формируют с помощ(.ю дил<)т)лгмт, 3 и фокусируют в центр измерительной

<амеры 5 с помощт ю лт<изы 4. 1ерез 1,5-?,0 мин cf«)т, рассеяниь;й движущимися I< JJ P T K (3 M Hl 6. -т и!< o T II (. . р е в - 3 5 чей стенки камеры 5 регистрируют фотолрттемником 7, иа выхоце;<оторогo попу"тлк)т за. гчет гетеродиьнтровлния модулировлтт)11>ттт электрический сигнал, посГупающий иа «хоп 1311 .кс(<тлстотного уси- (10

Лителя 10, где происхг<гтит усиление (1)лукту(итт<отптого сигнала до уроттня 2

3В, Из сигнала с. помо<цью коррелятора

11 стрОЯт кООреляционную фуикпию ра( сеянного света в реальном млс!!!та<<в

Времени при временах задержки 100 13(с и ве)!Ттч<тттотт вь<борки (ста и»тики) 2

) Тз

2, Корреттят< 1<1Hиая функция в (( виде цифрового сигнала поступает в оперативную память микро)BN 12, Из корреляционной функции по методу иаиченьщих квадратов Ттз1<)т(. кают величину скорости и числа иод!31!жных клеток 13 популяции микроорганизмов, информация о которых выводится, нлпример, на циф- ропечать 14. Бремя между с емлми информации Определяется с Ттомотттью тай-. мера 13. Бремя между съ(емами составляет 28 с. llo тому при угреднении изм(ряеftf;t>< плр:Тметт)0!3 !то 10 ПО(1<ецовлт()ТЬИьтт! ОТТЬтт )М (if)lll(P )

Относите.!т иук I)v.fttfifftfty знергозлтРлт ттл,(11)ижеfflfP кле-.ок f< попУJIH11HH с учетом текущей плотиостии ()рглиизМоЕ< в зон(иаблюпения выч!!Сляют Ilo формуле

2, т ) .( о < (р<) С (o ) Off

1, К ((о),. сре;тняя »корост! по ансамблю клеток микрооргат!Измов в зоне наб (а(т " к людеиия соответственно

В опыте и коитро.!е, мкм/с;

11 (3тт > !(0Tf f0 Jl(. ИИЕ ЧИСЛЯ тlо ПВИЖиьтх клеток в попу)тяции к !Ислу неподвижных соотттетгти(<иио в опыте и контроле, оти ед.;

Г(о),(т-(о) — значение корреляционной Отт функции ири т.реметти задержки, рлвиом ттулю (тоответстттеитто в опыте

Пример 1. По обоснованию выбора величины температурного скачка для изучения термочувствительности инфузорий Т. pyriiormis в оттьттах биотестирования.

Исследовали температурную зависимость энергозатрат популяции на движение инфузорий и вариабильиости их и контроле, усл.ед.

Результаты энергозатрат на движение клеток в популяции ири различных концентрациях химических веществ пред" ставляют в 13HJJp графика, при этом нижнюю границу токсического действия определяют IJO первому нику параметрической чувствительности энергозатрат на движение клеток в популяции, а максимально <топустимую концентрацию химического ве!!Тест)та — по второму пику плраметрической чувствительности„

Гсли необходимо уточнить состояние исходной популяции микроорганизмов, то по результатам токсикологических опытов для каждой концентрации химического вещества вычисляют величину нлриабильности отклик" популяции иа воздействие химического вещества. При этом полученные значения наносят на тот же график и в результате сравнительного анализа осуществляют учет текущего состояния популяции. (16881 б1

18 от<<< т<1<< l< 1<Оду<<ли!<и и эк п<1<<Р!п<иа<<ьIlo<«<гл е роста. ™ля это гс пробу куль-, туры и".<1<уз<арий помещали в изь<ерительпую хам< ру, к< торую термостатировлли

5 при за<<;«««1й т«мпс рлтуре в пределах от 22 pv, 42 С с изменением температу- а . ры на 2 С с точностью 0,1 С При о этом микроорганизмы выдерживали для каждой температуры н течение 4,0— ,5 мид. Контроль скорости, подвиж«ости клеток и энергозлтраты популяции проводили в 3-кратной повторности при стлтистике . 1стлновлено, что не

<7 только показатели движения имеют тем- 5 пературную зависимость, но и вариабильность имела сложную температурную зависимость. На фиг, 2 представлены экспериментальные результаты этих опытон, где график 1 — зависимость энер- 20 гозатрат па движение клеток к популяц«и, график 2 — вариабильность их ответа.

Как видно из температурных эависиц<остей, именно в диапазоне физиологи- 25

< о

:ческих температур от 22 до 30 С наблюдается арениусовский характер изменения параметра движения клеток, при этом в температуре влриабильность имеет минимальное значение, что указы-3р вает на устойчивое состояние популяции в этих условиях. Поэтому, если взять температурный скачок величиной б.Г от 22 до 28 С, то температурная о 0 чувствительность для контроля будет

35 иметь минимальную динамическую ошибку.

Экспериментально установлено, что при температурах выше 28 С в реакции тесто объекта возникают неустойчивые колебания параметров движения, что связано 40 с повреждающим воздействием температурного фактора, При меньших температурах от величины 28 С увеличивается вариабильность, что также повьш<ает

QItIHCKy измерений показателя термочув- 45 ствительности.

Таким образом, установление величины температурного скачка до 28+5 С обеспечивает достаточный уровень чув- gp ствительности тест-объекта с ошибкой не хуже 4,57..

Пример 2. По обоснованию выбора длительности измерения показателей рВККеННН инфузорий, ти термочувствительности, при наличии явлений фототаксиса и динамических процессов на температурный скачок до

28 С.

Суспензию микроорганизмов помещают в камеру, термостатировлнную с температурой 28 С, облучают лазерным светом в красном диапазоне и регистрируют в течение 5 мин через каждые 28,4 с эн pI озатраты на движение клеток в популяции, По девяти опытам вычисляли средние значения в каждой точке измерения и вариабильность этого показателя, Результаты экспериментов представлены на Аиг„ 3, где график 1 термочувствительность, график 2— вариабильность. Популяция находилась в зкспоненциальной фазе роста.

Из графиков на фиг, 3 видно, что энергозлтраты после температурного скачка, начиная с 1,5 мин вплоть до

4 мин, практически не изменяется, при этом вариабильность за это время изменяется в пределах от 24 до 34K, т.е. динамическая ошибка измерения оценки состояния по термочувствительности энергозатрат на движение клеток в популяции составляет менее 3,2<, что вполне удовлетворяет требованиям проведения опытов анализа текущего состояния тест-объекта в условиях специальных воздействий (температурного скачка) и случайных факторов (например, связанных с фототаксисом).

Вот почему в опытах по биотестированию испольэовали длительность измерения параметров движения инфузорий в ,интервалах от 1,5 до 4,5 мин.

Пример 3. По обоснованию

<выбора времени проведения опытов оценки токсического действия химичес- ких веществ в течение суток.

Панные исследования были проведены в связи с тем, что было известно о существенной су очной зависимости показателей жизнедеятельности ин<Ъузорий, Опыты проводили следующим образом.

Суспензию инфузорий помещали в камеру, воздействовали температурным скачком до 28 С с измерением в течео ние 5 мин термочувствительности энергозатрат на движение клеток в популяции в различное время суток. Результаты приведены на фиг. 4, где график

1 — термочувствительность энергозатрат, а график 2 — вариабильность. Популяция находилась в экспоненциальной фазе роста.

Учитывая длительность проведения токсикологического анализа, которая включает собственно время инкубации19

16881 )1

30 рии.

Пробы микроорганизмов инкубирова-. ли при 21-22 С в присутствии заданной концентрации токсикантов, после чего измеряли энергозатраты на движение клеток в популяции. На фиг. 5 представлены в кач .стве примера результаты экспериментов действия токо сикантов при 22 С„ где график 1 — с концентрацией 0,3 мг/л Сп+, грайик

2 — с концентрацией 1,5 мг/л Cu+, график 3 — с концентрацией 7,5 мг/л

Cu+ „ Все значения достоверны с величиной 99, .

1(ак видно из фиг. 5, в интервалах 30-60 мин инфузории изменяют свои параметры движения достаточно, чтобь; сделать вывод о токсическом действии„

Длительность инкубирования более 60 мин ограничивается требованием экспрессности контроля, а менее 30 MHH — ве;плчиной ошибки в динамике и требованием завершения фазы перестройки стимуляции.

Пример 5.. По обоснованию к зитерия токсического эффекта по анализу параметрической чувствительности в краткосрочных опытах с использовани м подвижных микроорганизмов — инфузор:лй

Tetrahymena pyrif:nrmis.

30-60 мин и время измерения параметров движения клеток в популяции (для десяти концентраций оно составляет

5х10=50 мин где 5 — время оценки

5 одной пробы), что в общем составляет

Порядка 80-110 минут, необходимо, наПример, проводить исследования в период между 14 ч. 30 и 16 ч 30 суточf t ного времени, так как именно в это

Время в меньшей степени сказываются суточные влияния на параметр термочувствительности энергозатрат на движение клеток в популяции. Па фиг. 4 эта. 06JIBcTh зйштрихован наблюдается состояние устойчивого равновесия. Если же с технологических позиций требуется проводить оценку токсичности в другое время, то необходимо учитывать суточную динамику 20 реакции тест-объекта в виде соответствующих поправок, что„ в свою очередь, обеспечит воспроизводимость и сопоставимость оценок токсического действия в опытах биотестирования. 25

Пример 4. По обоснованию длительности проведения опыта (инкубации) при оценке токсического действия химических веществ на инфузоИнкубацию инфузорий с химическим веществом проводили при температуре

21-22 С в течение 60 мин, скачок темо о пературы устанавливали равным 6 С от о

22 до .28 С и измеряли параметр термочувствительности энергозатрат на движение клеток в популяции в течение

4 мин. Результаты действия ионов меди представлены на фиг„ 6, где график 1 и 2 соответствуют энергозатратам и вариабильности для популяции в экспоненциальной фазе роста, а график 3 и

4 — соответственно для популяции в стационарной фазе роста. Экспоненциальную фазу роста наблюдали для 4-5 дневной культуры.

Из фазовой зависимости видно, что термочувствительность энергозатрат имеет два явно выраженных максимума первый при 0,312 мг/л Cu - и второй— при 5 мг/л Си+ (для экспоненциальной и стационарной фазы роста культуры).

При этом параметр вариабильности для экспоненциальной фазы имеет также два ярко выраженньгх пика при 0,6 мг/л Cu+ и 10 мг/л Cu+, а для стационарной фазы наблюдается один пик при концентрации 0,312 мг/л, причем второй пик не наблюдали при концентрации 10 мг/л

Cu, а лишь наблюдали некоторую тенденцию увеличения вариабильности в зоне концентраций 2,5 мг/л Сил . Из этого следует, что по вариабильности можно оценивать состояние исходной популяции. Этот показатель отражает внутренние свойства популяции в плане возможности перестройки своих энергетических характеристик.,пня опытов биотестирования предпочтительно использовать популяцию, находящуюся в экспоненциальной фазе роста, так как наличие второго пика вариабильности в зоне токсического воздействия химического вещества отражает более выраженную картину гибели организмов, С другой стороны разрешимость пикон чувствительности, которая определяется по формуле

К = 1/2/1, где 1/2 — ширина гика на полувысоте;

I, — расстояние между пиками, для популяции в экспоненциальной фазе роста намного выше,, А именно, первый пик в экспоненциальной фазе имеет

"размытость" 33,8%, второй — 28,,8%, а в стационарной — соответственно

56,3 и 46,3%.

21

В качестве другого примера действия химического вещества на фиг, 7 приведены результаты реакции инфузорий на этиловый спирт, где график 1 — чув5 ствительность энергозатрат инфузорий, а график 2 — вариабильность их отклика. Популяция в экспоненциальной фазе роста.

Из фиг. 6 и 7 следует, что нижнюю границу токсического действия вещества определяют по первому пику параметрической чувствительности энергозатрат на движение клеток в популяции, а максимально допустимую концентрацию 15 химического вещества — по второму пику параметрической чувствительности.

Сопоставляя значения соответствующих концентраций, делаем вывод, что для меди диапазон концентрации имеет значение 0,312 и 10 мг/л, а для этилового спирта — 62,5 и 10000 мг/л.

Таким образом, использование данно го критерия определения уровня токсического воздействия позволяет количе- 25 ственно оценивать токсический эффект и биологическую активность испытываемых веществ в краткосрочных опытах при высокой объективности, достоверности и воспроизводимости анализа. 30

Предлагаемый способ может быть реа" лизован на любой другой установке, которая позволяет получать информацию о скорости движения, подвижности клеток в популяции в реальном масштабе

35 времени методом корреляционно-доплеровской спектроскопии с .анализом температурной чувствительности параметров движения.

Использование способа наиболее эф- 4 фективно в задачах оперативного контроля качества. водной среды методом биотестирования в связи с особой важ-. ностью решения проблемы охраны окру- жающей среды. Кроме того, его целесо- 45 образно испольэовать при скрининге вновь синтезируемых химических веществ, например в медицине, ветерина" рии, сельском хозяйстве, пищевой, химической и парфюмерной промьппленнос-. .50 тях.Особое значение использование данного способа имеет при биомониторинге и оценке состояния водных систем в экстремальных ситуациях воздействия, например, в особый период. 55

Таким образом, измерение параметрической чувствительности параметров движения клеток в популяции путем контроля флуктуаций рассеянного света движущимися клетками микрооргянизмс в методом корреляционно-доплеровской спектроскопии позволяет с большой точностью оценить реакцию тест-объекта в реальном масштабе времени в условиях краткосрочных опытов. При этом получают объективную информацию о движении клеток с получением количественных характеристик энергозатрат популяции на движение клеток.

Выбор режимов измерения практически исключает влияние на результаты эффектов фототаксиса, суточного ритма, кинетики переходных процессов на температурный скачок с учетом фазы развития популяции.

Наличие большой статистики выборки ,при анализе рассеянного света движущи1 мися организмами позволяет получать статистически достоверные сдвиги энергозатрат на популяционном уровне при исследованиях токсических эффектов на подвижных микроорганизмах (гидробионтах). формула изобретения

1. Способ определения токсического воздействия химических веществ, содержащихся в водной среде, на культуру планктонных гидробионтов, предусматривающий культивирование планктонных гидробионтов в опытных и контрольных термостатируемых камерах, введение в опытные камеры исследуемой среды, выдерживание культуры гидробионтов в присутствии исследуемой среды, измерение при выдерживании средней скорости движения по ансамблю гидробион-. тов в опыте и контроле методом корреляционно-доплеровской спектроскопии, оценку отношения числа подвижных гидробионтов в культуре к числу неподвиж- ных соответственно в опыте и контроле, оценку по полученным данным величины энергозатрат гидробионтов на движение и суждение о токсическом воздействии исследуемой среды по величине энергозатрат гидробиоктов на движение в опыте, отличающийся тем, что, с целью повышения точности оценки за счет определения уровней токсического воздействия исследуемого вещества и сокращения расхода исследуемой среды и культуры гидробионтов, во время выдерживания культуры гидробионтов в присутствии исследуемой среды осуществляют изменение температуры среды со24

1 г, 1) « 1 () 1 роле, отн, ед..; (;(о),((о) — кспгцентрация гидробионоп к тов в зоне наблюдения, усл.ед.> при этом нижнюю границу токсического действия исследуемого вещества в среде определяют по первому пику величины энергозатрат гидробионтов на движение в культуре по графику, а максимально допустимую концентрацию исследуемого вещества в среде — по второму пику величины энергозатрат. г к, ° G()<

2„ Способ по п„ 1, о т л и ч а ющ и " с я тем, что изменение темпера1 туры содержания гидроби<.нтов осуществляют путем повыи1ения температуры с

2? до 28 С.

Скорость дни- Подвижность

Энергозатраты

Уровень градации измеряемых величин, отн,.ед,, жения

Плот- Число

"!исло опытов

Плотность вероятносПлотность

Число опытов нос гь вероятносопытов вероятности ти ти

0 1 1/7 2 2/7

4/7 2 2/7 1 1/7

3/7 3 3/7 2 2/7

0 i 1/7 2 2/7

Мень1ие О, 7 )

0)75-1,00

1,00-1, 25

Болыие 1,25

ТЗ держания гпцробионтon 11 опыте и контроле, а и процессе измерс.ния дополнителт-.но оценивают кс)нцснтрацию гидробионтов в зоне наблюдения, строят график зависимости величины энергoзатрат гидробионтов от к<)нцентрации исследуемого вещества н исследуемой среде, величину энерг<)затрат гидробионтов на движение (4) оценивают по

AopMyле где v, v — средняя скорость движе15

<К1 ния по а11самблю гидробионтов 1 зоне наблюдения в опыте и контроле,мкм/";

О т н О <П е 11 И е ч И с Л а I Io JI B H3K 1

?О гидробио Iron к числу непс1днижных н опыте и конт60

М с

40

38 42

Температура, С о

Фиг.2

40й

I00 о о50

1,, Г с

I40

280 о ъ

Q3

С4

Я-а

CG (6 с

Гл

С4

Ю х

22 26

2I5

Время, сек. ь4 о о х ю4

50 о

Щ

Р

Ф (ч о о х

0 о

Щ

М

Р а

1608161

k(2,0 (ч о

7 5мГ

l

I,0

I5 т ксикант

Фиг.5

Врамя, мин,,и и

Ф

2,0 !

I,0

Ь о

Д з,о, с

Се

Д 20

Дйгптвьныи энергазагпраты, усп. й

П Т 4 б // /О // /4 /Ю /// Z//

Вреия суван, час

Фаг. 4

30 45 60 75 90

И0

20

Фиг.6

I50

Юо

Двигательные анергозатраты, уел.ед, I 25 2 Г б

ЕОНЦЕНтраЦИЯ, 4Р/Л.

Вариасилъность, g

00 10000 80000

Концентрация, мг/л

Ь

I сОж