Способ определения антилизоцимной активности штаммов менингококка

 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии. Цель изобретения - упрощение способа, поИзобретение относится к области медицины , а именно к медицинской микробиологии . Лизоцим обладает способностью подавлять рост многих бактерий. Поэтому штаммы микроорганизмов, которые ингибируют данный фермент, получают существенное преимущество в межвидовой конкуренции. Они лучше выживают и при внутриклеточной локализации. Переваривание антилизоцимных штаммов в фагоцитах протекает во много раз медленнее, чем клеток , не обладающих активностью в отношевышение чувствительности и ускорение определения активности. Способ заключается в приготовлении взвесей изучаемых штаммов мэнингскокков с концентрацией 5.0- 10,0 млрд, микробных клеток на 1 мл раствора лизоцима. внесении их в грздпент концентрации лизоцима, инкубировании 30-60 мин смеси с последующим определением остаточного лизоцима и засевом в лунки гельбзктериальной полиакриламидней среды, включающей т е с т - -- у л ь т у р у Micrococcus Lysodekticus. Причем градиент концентрации фермента готсеят из расчета 0.25. 05 и 1.0 . Способ позволяет с ei- сокой слеленью -сч.гс определить способность штаммов инг/Ьиро- t я т ь фермент в условиях, близка к внутриклеточному паразитироззкньг1 микроорганизмов , в 12-15 раз сократить сроки исследования и значи ельно упростить и удешевить метод определения зчтилизоцимчой активности с..ежевыделемных штаммов менингококка. 5 табл. (Л С нии Фермента. Кроме того, микроорганизмы с указанными свойствами способны к внутриклеточному размножению. Менингококки относится к внутриклеточным паразитам и обладают антнлизоцимнсй активностью (АЛА). Широкий диапазон значений АЛА характерен для различных штаммов и даже клонов популяции. Наличие этого фактора расценивается как один из возможных показателей патогенности микроорганизмов, который может быть использован при эпидемиологической характеристике штаммов. vj О vj О ГО

СОУ33 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л С 12 О 1/34 1/08

ГОСУДАРСТВЕ НЧЬ и КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

CO

С

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4733637/13 (22) 29.08.89 (46) 23.01.92. Бюл. М 3 (71) Харьковский на) но-исследовательский институт микроб 1ологии, вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова, Харьковский научно-исследовательский институт эндокринологии и химии гормонов (72) Е.М. Бабич, Л.П.Пивсваревич, И.Б.Васильева, С.А.Деркач, В.И.Белозерский.

И.В.Елисеева и В.П.Пимченкс (53) 576.8.093. 1(088.8) (56) Борисов С.Д. Антилиэоцимная активно ть мен 1 гоколксв и ее применение в диагностике мен,1нг iкокксвсй инфекции.

Автореф.канд.мед. Челябинск, 1988. с.19 (54) СПОСОБ 0

Цель изсбпетения — упрощен е способа, поИзобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии.

Лизоцим обладает способностью подавлять рост многих бактерий. Поэтому штаммы микроорганизмов, которые ингибируютданный фермент, получают существен. ное преимущество в межвидовой конкуренции. Они лучше выживают и при внутриклеточной локализации. Переваривание антилиэоцимных штаммов в фагоцитах протекает во много раз медленнее, чем клеток, не обладающих активностью в отноше„„SU „, 1707624 А1 вышение чувствительности и ускорение определения активности. Способ заключается в приготовлении взвесей изучаемых штамMOB менингскскков с концентрацией 5.0—

10,0 млрд. микробных клеток на 1 л л раствора лизсцима, внесении их в;рад ент концентрации лизоцима, инкуб.1рсвании

30 — 60 мин смеси с псследу1ощилл с прейс -ением остаточного лизоцима и засеве,. я пучки гельбактериальной полиакр 1.а ли,-. с Й среды, включающей тест--. .lül уг у

Microcosmos 1уво.1ел,1с :. При егл i ра„-и -:т концентрации фермента готовя.. раде."ь-о из расчета 025, 05 и 1.0 м. /i," С-сссб позволяет с pt: "ñêñé степенью -"ч- -; с lределить споссбнос ь штаммсв инг upof ать Чермент в у»лсвия б "иэк < K внутриклетсчному параэити;.вян;ii. микроорганиэллсв. в 12-15 рлэ сс ратить сроки

ИССЛЕдОЯАНИ» И ЗНаЧИ =ЛЬНO уПрэCTi;т-в И уae e!«lь ме1сд определения уров -1тиЛИЗОЦИМНСЙ аКТИВНОСТИ С .ЕЖЕВЫДЕ 1": .HhlX штаммов менингококка. 5 та"л. нии фермента. Кроме того, л1икроорганизмы с укаэанными свойствами способы к внутриклеточному размножению.

Менингококки относятся к внутриклеточным паразитам и обладают ант 1лизоцимнсй активностью (АЛА). Широкий диаса".сн значений АЛА xapa>терен для различных штаммов и даже клонов популяции.

Наличие этого фактора расценивается как один из возможных показателей патогенности микроорганизмов, который может быть использован при эпидемиологической характеристике штаммов.

1707624

Известны различные модификации одного способа определения антилиэоцимной активности штаммов менингококка — определение АЛА на плотных питательных средах, содержащих - определенные концентрации кристаллического лиэоцима, Недостатками данного способа являются сложность постановки опыта, недостаточная чувствительность теста и длительность исследования, Наиболее близким у предлагаемому являтеся метод, основанный на создании градиента монцентрации лиэоцима на одной чашке с плотной питательной средой. В чашку Петри вносят 20 мл расплавленного агара и ставят в наклонное положение для получения скошенного агара. После застыаания среды чашку кладут строго горизонтальное положение и заливают 20 мл

20 Я,-ного сывороточного агара с лиэоцимом в максимальной исследуемой концентрации

20-30 мкг/мп. После охлаждения образуется среда, имеющая градиент концентрации лиэоцима. На поверхность агара стандартной петлей (d 3 мм) наносится непрерывной полосой по направлению градиента концентрации лиэоцима взвесь исследуемо,< 18-24-часовой культуры л<енингококка (10 КО Е /мл).

Через 18-24 ч инкубации в термостате при 37 С культура обрабатывается парами

° пороформа и заливается 0.1 мп взвеси индикаторного штамма микрококка (10

9 л. Е/л<п) в 4 мп 0.7- -ного питательного агара Чашки вновь-г<омещают в термостат при

37 С. Учет результатов проводят по наличию роста М.lysodeikticus вдоп полосы исследуемой культуры. За уровень антипиэоцимной активности принимают мак.симапьное значение концентрации фермента. при которой еще стмезется рост .,, о к о к к а ..

Недо=та;ком уväэаинэго метода является то. что он не позволяет изучить антилиэоцимную ак1ивность штал<л<ов в жидких средах. т е. в условиях, близких к развитию менингококков в биологических жидкостях, в тол. испе, внутрикпеточног0 паразитирования. Крол<е того, постановка спыта довольно сложная, требует значительного расходования питательной среды и сопряжена с длительностью исследований (не менее 48 ч). Указанная методика определения

AflA может давать существенные отклонения в результатах, связанных с различным числом жизнеспособных клеток во взвеси. взятой для посева менингококка на агаровую среду, и неодинаковой скоростью его размножения. что затрудняет стандартизацию условий постановки данного теста.

Целью изобретения является упрощение способа, повышение чувствительности и ускорение определения.

Цель достигается путем приготовления

5 вэвесей культур изучаемых штаммов менингококка в жидкой среде, содержащей различные концентрации лизоцимв, инкубирования смесей в течение определенного времени при 37 С, определения в

10 .них содержания остаточного лизоцима с использованием высокочувствительной полиакриламидной среды, с последующим вычислением инактивированных штаммов доз фермента. 3а уровень антилизоцимной

55 активности принимают максимальную концентрацию лизоцима, полностью анактивированную взвесью менингококка, Применение полиакриламидной среды позволяет выявить концентрации фермента (менее 1 мкг/мл), которые известным способом не могут быть обнаружены, и сократить сроки исследования до 2-4 ч вместо 48 ч.

Параметры постановки теста — концентрации культур менингококка и растворов пизоцима, время инкубации, критерии оценки активности штаммов по антилизоцимному признаку, определены следующим образом.

8 опыт брали суспенэию культуры менингококка (этапонный штамм <ч . 0646) различной концентрации от 1 до 15 млрд микробных клеток на 1 мл дистипп,<рованной воды. Полученные данные (табл.1) свидетепьс<вуют, ч.о одномиплиардная взвесь не подавляла в течение 1 ч лизоцимную активность в стандартных растворах. Увеличение концентрации менингококка до 2,5 млрд клеток в 1 мл суспензии позволило во всех случаях ингибировать 0,1-0.25 мкгlмл лизоцима, Угнетение фермента в дозе 0,5 мкг/мп наблюдалось лишь в отдельных случаях. Содержание л<.<кробных клеток в пределах 5-10 мп рд! мп давало постоянные результаты, во в:ех стандартных растворах с концентрацией пизоцима 0,1-1,0 мкгlмп в течение 1 ч было отмечено ингибирование фермента.

Более высокое содержание микробных клеток (15 млрд/мл) в смеси подавляло активность фермента в -диапазоне 0,1-2,0 мкг/мл, однако повторяемость результатов наблюдалась лишь при исследовании растворов, содержащих 0,1-1,0 мкг/мл фермента. Исследование образцов с концентрацией лизоцима 2,0 мкг/мл позволило выявить а 1тилиэоцимную активность менингококка только в отдельных опытах.

Отсутствие стабильности результатов при использовании двух с половиной и пятнадцатимиллиардной микробной взвеси в рас1707624 творах 0,5 и 2,0 мкт lмл лиэоцима соответственно явилось основной причиной для ограничения минимальных и максимальных значений концентрации менингококка 5-10 млрд микробных клеток в одном миллилитре смеси.

Чувствительность теста обусловлена также длительностью инкубации культуры менингококка с лизоцимом. Соответствующие данные представлены в табл.2. Как видно из полученных данных табл.2, пятнадцатиминутная экспозиция оказалась недостаточной для проявления антилизоцимной активности менингококка. Ингибирование лиэирующего действия фермента в концентрации 0,1 — 1.0 мкг/мл во всех опытах наступало в те ение 30-60 мин, поэтому увеличение вре? (и экспозиции более 1 ч нецелесообразно. В контрольных образцах, не содержа;;1х культуры менин? ококка, активность рас1ворэ лизоцима в течение 1 ч не изменялась.

Применение стандартных рВОТВороВ лизоцима по"-, сляет значительно сократить сроки определения антилизоци лной активности штамл1ов благодаря учету результатов по времени появления начальной эоны лизиса тест-культуры B гельбактериальной среде беэ использовл? 1 я калибросоной кривой. Как показало экспериментальное изучение много и ленных контрольных обргзцoB раствор(B л/зcö fìа с конценTрацией 0,25- 1.0 мк? />лл ча полиакр 1;,cir, 1дной гельбактериаль 3; cpe„.å, применяемой в данном cf1cco5c;. вр=-?ленные параметры ик

ЛИЗИРУЮЩЕ?О Зфф-..r.та ВСЕ?Да НаХОДИЛИСЬ В

ПрЕдвлах От 30 л1?1н до 2ПарамЕтрЫ уро= =; а 11лизсцимнсй

Br.TviBHocTH по предла аем ?1I спс=обу огределены на 25 LJ 3 11 "ак мечичгококка. Все взятые в опыт к,;,ьтуры предварительно изучались с пол 3 ьс изв, стч;о теста и были сгруппированы f10 способности инактив 1ровать различчые концентрат.?ии фермента следующи,л образ м. 7 штам?лов с низкой АЛА(ича тив рвали 1-5 мкг/мл лиэоцима). 8 шта? IM(B со средней АЛА (6-10 мкг/мл) и 10 шта?л -1св с высокой А/1А (инактивировали 10 мкгlмл и более).

Результаты изучения антилизоцимной активности этих ТВММоВ по предлагаемо-. му способу представлены в табл.3, Как следует из табл.3, кснцентрация инактивированного лизоцима прямо коррелировала с уровне АЛА штаммоа менингококка, определенной известным способом.

Полученные cpaBI-IvTeff fiofe данные св.1детельствуют также о том, что характеристику штаммов можно проводить с помощью трех контрольных растворов лизоци?ла с концен5

f5

30 Э

f=5 трацией 0,25; 0,5 и 1 мкг/r n и оцени? 31ь полученные результаты сле,1ующи?л обрэзом: при инактивации 0.25 мкг/мл лиэоцима

ШтаММЫ МЕНИНГОКОККа СЧИтатЬ Н11ЗКОаКтИЯными; при 0,5 мкг/мл — среднеакт1 вчыми и при 1 мкгlмл — высокоактивными антилизоцимному признаку.

Продолжительность исследовани11 ча полиакриламидной гельбактериал чой среде в опытных образцах представлена в табл.4.

Обнаружение в течение 2 ч лиэирующего эффекта смесей культуры менингококка и лизоцима при концентрациях последнего

0 5 и 1 0 икг/мл указывает на низкую способность штаммов ингибировать фермент, Наличие зон лизиса в указанный промежуток времени при исследовании образцов,. содержащих только 1 мкгlл1л лизоци?ла. характеризует среднюю активность штамма, а отрицзтельные результаты при исследовании всех растворов — сысокую ачтилизоцимчую активность культур мечин? ококка.

Таким образом, для определения АЛА штаммов мсчингокскка целесообразно использовать водную суспечз11?о исследуемо1о штамма, сздержасцую 5,0-10,0 млрд микробных кле? ок MB 1 M,I саствсра лизсц™.— ма (концентрации 0,25, 0.5 и,0 л хг, мл), инкубировать с1лесь B течечие 30-50 мин при37 С, f!oc"е ?о, 1редел ть сл, чество о ингибирпва ?: о фес?лента ол!(..?,iс полиакр?!лсл1и,л и т, ь зкт клз,;ьнсг1 ч(ы в те1 ч;" не бзлее. ч

Cnoс -б (:у л;ествляе-ся .-еду»3 ",:1 .. (5азсм.

Сутo1ную культур; мечичтoro а смыВаf(ò !1(TI1?I Лl!Р БЛH? „(1 B(Д 1 ИBI ф„1 I!O;1 тическил раство";л с рН 6,2 и готовят густу?о взвесь, состаетс1вующую ..ycTCTB

50-100 мл„д/мл по оптическол1у ст: .д„"арту

n;oT ности CI СК и?л.Тарасевича. Г(-, ьчт растворы с различной концечтр?,:11 ей; изоцима (0,25; 0,5 и 1,0 м;г/Mn) и азливзют в пробирки по 1 мл (oo 2 пробирки ча каждую концентрацию лизоцима). В каждую опытную г,робирку внос т л1икробную взвесь из р=.(чЕта 5.0-10.0 тллрд/мл и инкуС 1руЮт есь гри температуре 37 С в течение 30г>0 ?лин, Контролем являются стандартные раствсры лизоцима без бактериальной культуры. Затем содержимое каждой пробирки (опытной и контрольной) вносят в заранее приготовленные лунки гельбзктериальной среды и инкубируют в течение 2 ч при 37 С. Результаты учитывают визуа."ьчо ffo появлению зон лизиса или ho их от=утстви о вокруг лунок с исследуемой лл1крсС.1зй суспензией. Определяют какие макслл1альные дозы ферм(и?а ингибирова1707624

15

30

40

55 ны. Штаммы менингококка считают низкоактивными по антилиэоцимному признаку, если они подавляют действие лизоцима только при концентрации последнего 0,25 мкг/мл; среднеактивными — 0.25 и 0,5 мкг/h»n высокоактивными — 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/мл.

Пример 1, Выросшую в чашке Петри суточную культуру менингококка смывают двумя миллилитрами дистиллированной воды. С помощью оптического стандарта мутности определяют густоту взвеси и доводят ее до мутности, соответствующей 50 млрд микробных клеток в 1 мл.

Готовят стандартные растворы кр11сталлического лизоцима для чего растворяют 10 мг лиэ0цима в 50 h1r дистиллированной во.„и (конечная конценгрзция 200 мкг/мл), затем. 2 мл данного рз=т срз соединяют с 48 л1л дистиллированной водяI (концентрация

О,:" во 13 8 мкг/л1,".) ь1 сз т :. ры можно .."„,вниз ь грит:-,мiicpзт>ге 4--:. С в1е е 11е 30 и 6 д е 1 ссотгет:тз:-нно.

Из последне О разве,; ния гогозят е»

emporae рзбоч11й раствор. годер 1:зщий 1 мкг/мл лизоцима. Для этого к 0,5 мл раствора ссдержзшег", 8 л"-:, фер .;cчта, добавляют 3,5 м дi1стнл "роз HHOI; годы

Д .я получен; .1; з;творя с б лег низкой концен1рзцией лиз l л1з сл1сLL 1EIàtoT 0,5 h11 ро-бочего рзство„з лизоц„мз с 1,5 л;; дпсти IëtlpoíGHной E лы (,GH:.j r трзц я 0 25 м.. м,I) 1 мл „".= 0:I rc рз т=-) з — с 1 мл в ды,кон: Tp3 . "ë 0 5 ttKг t. l

Кз»ы;1 из ОО;"".-GLi-енч . х рзстворов ли Оцl t4 ñ. сод. рж".-. .lltl» 1, 5, 0,5 и 1 л»кг/млл фер .1ента. вносят го 0.9 и": в две прс6.1prt... п2Овьц1 рЯд До зв чя гот по 0, 1 v,-: 0 млр" ми pc6ной взвеcè из; àåл1c о ш змл1а менингоко кг, второ 16=pут в ..зчес. ае кснтрсля Все пр бирки IIHt.у5 .ру .-т в те ение 30 м; при 37 С затем 11сслед .;т нз ..зоцимную активность с исп;.л зоь. .:. ьм rcäü6àhтериальной среды. Гель =.зктес. з.;ьнзя среда готовилась из рез».ц«с,.на. смес"„

СсдЕржащЕй 5 at.р лзм1да, 0i,2 t!,N -метИЛЕН-6 1С-ЗКрИ-Зл1Ида; 0,3 МЛ N,N,N,N -твтрал1етилэтилендизл1ина: 0,12 г калия персульфата и 0,145 r тест-культуры

M.!ósoGå ficus в 90 мл буф.=рнcro раствора с рН 6,2.

Стекла с внесеHныMi1 в лунки сi;pззцами растворов и сл1есей инкубиру от при 37" С в течение 2 ч. Учет резу ьтзтов, проявившихся на гельбактер 1зльно11 среде. показал, что опытные образцы, содержащие лизоцим в концентрации 0.25; 0,5 и мкг/мл, не вызывали лиэиса микрококка, тогда как соответствующие контрольные растворы его лизировз..и в TP 1ение 2 ч инкубации таким образом изучаемая культура менингококка способна ингибировать лиэоцим в максимальной дозе 1,0 мкг/мл, т.е, является высокоактивной по антилизоцимному признаку. При определении известным способом штамм инактивировал 15 мкг/мл лиэоцима, Пример 2. Изучали уровень антилизоцимной активности свежевыделенного из спинномозговой жидкости больного гнойным менингитом штамма манингококка. Готовили 100 млрд взвеси суточной культуры и растворы лиэоцима той же концентрации

0,25; 0,5 и 1,0 мкгlмл. Все последующие операции проводили способом, описанным в примере 1, Время инкубации взвесей 60 мин, Опытные образцы взвеси менингококкз, содержащие лиэоцим в концентрации

0,25 и 0,5 мкгlмл, лизиса тест-культуры не вызывали. а с 1.0 мкгlмл дали хорошую видимую зо у лизисз уже через 40 мин инкубзции в термостате. Изучаемый штамм л1енингоко .ка является среднеактивным по антилиэс циtëíct",ó прk1знаку, так как максиh1GflbHo оН спогобен инактивировать 0,5 мкг/мл PHoöèìç, При определении АЛА извесTHLlt способом данный штамм инактивирОвзл 6 мкгlмл л 1ЗОцима. При иЗучЕнии предлзгаемь h1 способом 28 носоглоточных штзл1л1Ов м,lr pccðr íI1çìoâ. выделенных оТ

19 Общзв ихся с больным лиц в очаге менл1нгококковой инфекции. было установлено, что 5 культур оказались высокоактивными (инактивировали 1 мкг/мл лизоцил1з), 14 — среднеактивными (инактивировали 0,5 мк г/л1л фермента), а 9 всесе не обладали антилизоц.1л1но, активностью.

Результаты пр,1 этом были получены в течение 4 ч от начала исс. едовзния со значительно мечьшей затратой рабочего врел1ени и питательных сред.

Сравнительные дзнные применения предлагаемого и известного способов свидетельс-,вуют о том, что определение АЛА штамл1ов мен 1н. Ококка E жидкой среде имеет ряд су ес-венных преимуществ (табл,5).

По предлагаемому способу используется небольшое количество сред, себестоимость которых значительно ниже применяел ых в известном тесте. В качестве объекта исследования вместо растущей культуры применяют микробную взвесь, что позволяет стзндартиэовзть методику определения антилиэоцим.-1ой активности штаммов.

Изучение антилиэоцимной активности штаммов менингококкв в жидкой среде с использованием раствора лизоцима и чувствительной гельбактериальной среды поэво1707624

15

Таблица 1

Таблица 2 лает определить способность штаммов ингибировать фермент в условиях, близких к таковым при внутриклеточном паразитировании микроорганизмов, сократить в 12-15 раз время исследования и значительно упростить способ определения АЛА.

Формула изобретения

Способ определения антилизоцимной активности штаммов менингококка, предусматривающий приготовление взвеси менингококка в жидкой среде, внесение ее в градиент концентрации лизоцима, инкуоирование с последующей оценкой антилизоцимной активности по характеру роста тесткультуры Micrococcus i ysodekticus. о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения чувствительности и ус5 корения определения, концентрацию взвеси менингокпкка устанавливают равной

5,0-10,0 млрд микробных клеток на 1 раствора лизоцима,градиент концентраций фермента готовят из расчета 0,25; 0,5 и 1,0

10 мкг/м раздельно, полученную взвесь инкубируют в течение 30-60 мин, э затем вносят ее в лунки гельбактериальной чолиакриламидной среды, включающей тест-культуру.

1707624

Т аблица 3

Таблица 4

П р и м е ч а н и e . ."-" — отсутствие лизирующего эффекта.

"+ — наблюдается лиэирующий эффект.

Таблица 5

Среда

Срок определения. ч

Расход на одно определение, мл

Исследуемый объект

Определение антилиэоцимной активности по способ

Агар Хоттингера

Лошадиная сыворотка

Агар Дифко

Культура менингококка в фазе роста

44

2,5 — 4

Дистилированная вода

Полиакриламид

Культура менингококка в фазе покоя

Редактор Л. Гратилло

Заказ 268 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

flnr ичя чс> ppн о-издательский комбинат Патент, Г. Ужгород, уп.ÃÇÃý()èíý. 101

На твердых средах(известный ): приготовление двухслойного агара применение хлороформа наслаивание гельбактериальной среды

В жидкой среде(предлагаемый): приготовление микробной взвеси приготовление гельбакте иальной с еды

Составитель Е. Бабич

Техред М,Моргентал Корректор Н. Ревская