Способ получения клеток костного мозга для цитологического исследования

 

Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии. Целью изобретения является выделение эндотелиоидных островков из костного мозга. Для этого костный мозг вместе с костью инкубируют в растворе ферментов, наслаивают на среду, состоящую из фиколла 400, диатриозата натрия, верографина, собирают слой, содержащий фракцию, обогащенную эндотелиоидными клетками, и окрашивают гематологическими красителями.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4441746/14 (22) 15.06.88 (46) 23,03.92, Бюл, N. 11 (71) Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра

АМН СССР (72) Е.Д.Гольдберг, В,П.Шахов, А.М,Дугай, Е.B,Ñèìàíèíà и И,А.Хлусов (53) 616.089.9 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1633318, 1989. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО

ИССЛЕДОВАНИЯ

Изобретение относится к медицине, конкретно к гематологии, и может быть использовано для изучения эндотелиоидных форм гемопоэтических островков в норме и при различных патологических состояниях системы крови (анемии, лейкопении, лейкоцитозы, эритроцитозы, облучение, токсическое воздействие на гемопоэз и др.), Целью изобретения является получение эндотелиоидных островков.

Способ осуществляют следующим образом.

Костный мозг вместе с костью инкубируют при 37 С в течение 60-90 мин в 0,10,2%-ном растворе коллагеназы, затем инкубируют при 37 С в течение 30-45 мин в

0,2-0,3%-ном растворе тоипсина, фиксируют в 0,125%-ном растворе глютарового альдегида 10 мин, механически разбивают его на фрагменты, наслаивают на среду, состоящую из мас,%; фиколл-400 1,9-2,85; диатриозат натрия 3,0-4,5; верографин 30-45; вода — до 100, центрифугируют при 1000„„Я „„1721467А1 (si)s G 01 N 1/28//А 61 В 10/00 (57) Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии. Целью изобретения является выделение эндотелиоидных островков из костного мозга. Для этого костный мозг вместе с костью инкубируют в растворе ферментов, наслаивают на среду, состоящую из фиколла 400, диатриозата натрия, верографина, собирают слой, содержащий фракцию. обогащенную эндотелиоидными клетками, и окрашивают гематологическими красителями.

1500 об/мин в течение 5-10 мин, собирают интерфазный слой(расположенный над средой и содержащий обогащенную фракцию эндотелиоидных островков) и окрашивают гематологическими красителями.

Пример 1. Бедренную кость мышей линии CBA помещают в 1 мл 0,15%-ного раствора коллагеназы и инкубируют при

37 С в течение 70 мин, переносят в 0,25%ный раствор трипсина на 40 мин при 37 С. после чего фиксируют в 0,125%-ном растворе глютарового альдегида 10 мин, вымывают содержимое бедренной кости дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты и наслаивают на среду, состоящую, r: фиколла-400 3,5, диатриозат натрия 5,0; 50,0 г верографин 50,0; вода — до 100, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Затем фрагменты костного мозга, расположенного над указанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таб1721467 лица), что среди них присутствовали только макрофагальные или фибробластоидные, но не эндотелиоидные островки.

Пример 2. Бедренную кость мышей линии СВП помещают в 1 мл 0,15 -ного раствора коллагеназы и инкубируют при

37 С в течение 70 мин, переносят в 0,25 ный раствор трипсина на 40 мин при 37 С, фиксируют в 0,125 -ном растворе глютарового альдегида 10 мин, вымывают содержимое костномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, наслаивают на среду, состоящую, г: фи колл-400 1,9; диатриозат натрия 3,0; верографин 30,0, вода — до 100, и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин, Затем фрагменты костного мозга, расположенные надуказанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таблица, фото}, что наряду с макрофагальными и фибробластоидными островками определяет ся еще один тип ГΠ— эндотелиоидный.

Пример 3, Бедренную кость мышей линии СВА помещают в 1 мл 0,15 -ного раствора коллагеназы и инкубируют при

37 С в течение 70 мин, переносят в 0,25 ный раствор трипсина на 40 мин при 37 С, фиксируют в 0,125 -ном растворе глютароаого альдегида 10 мин, вымывают содержимое костномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, которые наслаивают на среду, состоящую, г; фиколл-400 2,5; диатриозат натрия 3,5; верографин 40,0; вода — до 100, и центрифугируют при 1250 об/мин в течение 7 мин. Затем фрагменты костного мозга, расположенные над указанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таблица, фото), что наряду с макрофагальными и фибробластоидными островками определяется еще один тип ГΠ— эндотелиоидный.

Пример 4. Бедренную кость мышей линии СВА помещают в 1 мл 0,15 -ного раствора коллагеназы и инкубируют при

37 С в течение 70 мин, переносят в 0,25 /ный раствор трипсина на 40 мин при 37 С, фиксируют в 0,125 -ном растворе глютарового альдегида 10 мин,.вымывают содержимое костномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, которые наслаивают на среду, состоящую, г: фиколл-400 2,85; диатриозат натрия 4,5; верографин 45,0; во5

55 да — до 100, и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Затем фрагменты костного мозга, расположенные над указанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таблица, фото), что наряду с макрофагальными и фибробластоидными островками определяется еще один тип ГΠ— эндотелиоидный.

Пример 5. Бедренную кость мышей линии СВП помещают в 1 мл 0,15 -ного раствора коллагеназы и инкубируют при

37 C в течение 70 мин переносят в 0,25 ный раствор трипсина на 40 мин при

37 С, фиксируют в 0,125 -ном растворе глютарового альдегида 10 мин, вымывают содержимое костномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, которые наслаивают на среду, состоящую, г: фиколл-400 1,0; диатриозат натрия 2,0; верографин 25,0; вода — до 100, и центрифугируют при 500 об/мин в течение 3 мин. Анализ морфологического состава ГО (таблица) показал, что ни в одном случае эндотелиоидные островки обнаружены не были, Предлагаемый способ позволяет получить в неразрушенном виде эндотелиоидные островки, изучить их структуру, исследовать межклеточн ые взаимосвязи, определить качественный состав ассоциированных с эндотелиоидными элементами гемопоэтических островков, что может быть использовано в гематологии для оценки состояния кроветворной ткани в норме и при различных патологических состояниях (анемии, лейкозы,.лейкопении, токсические повреждения, действие излучения и др.).

Формула изобретения

Способ получения клеток костного мозга для цитологического исследования путем инкубации костного мозга вместе с костью при 37 С в 0,1-0,2 /,-ном растворе коллагеназы в течение 60-90 мин, затем в0,,2-0,3 ном растворе трипсина в течение 30-45 мин, фиксации в 0,125 /-ном растворе глютарового альдегида в течение 10 мин с последующей механической разбивкой и окрашиванием, отл и ч а ю шийся тем, что, с целью получения эндотелиоидных островков, костный мозг после механической разбивки дополнительно наслаивают на среду, состоящую из 1,9-2,85 -ного водного раствора фиколла-400, 3,0-4,5 /-ного раствора диатриозата натрия и 30-45 -ного раствора верографина, и центрифугируют при 75-100 С в течение 5-10 мин.