Способ определения активности киллеров

 

Изобретение относится к клинической, иммунологии. Цель изобретения - повышение точности способа, а также сокращение времени анализа. Из крови обследуемых выделяют клетки-эффекторы в градиенте плотности, освобождаются от макрофагов путем их прилипания к пластику. Затем клетки-эффекторы смешивают с клетками мишенями К-562, дополнительно очищенных в градиенте плотности. Смесь клеток помещают в питательную среду, содержащую 0,1-0,2% трипановой сини.и 0,5-0,6% агара. Соотношение эффектор:мишень составляют равным 15-25:1. Клеточную взвесь в среде упомянутого состава помещают в плоский капилляр. Концы капилляра закрывают и инкубируют в течение 4-5 ч при37°С. По окончании инкубации под микроскопом просчитывают процент прокрашенных клеток-мишеней К-562. Этот процент отражает функциональную активность киллеров. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа в 2-3,5 раза с сокращением времени анализа в 4-4,5 раза.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР РOll O2

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 (21) 4841665/14 (22) 15.05.90 (46) 1 5.04.92. Бюл. N 14 (71) Институт иммунологии (72) М.З.Саидов, Б,В.Пинегин и А.Б.Алкеева (53) 615.375 (088.8) (56) Bloom E„Dunsworth-Browne М., QurkosSmith О. — Urol. Res. 1981, 9, р, 219-225.. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КИЛЛЕРОВ (57) Изобретение относится к клинической. иммунологии. Цель изобретения — повышение точности способа, а также сокращение времени анализа. Из крови обследуемых выделяют клетки-эффекторы в градиенте плотности, освобождаются от макрофагов путем их прилипания к пластику. Затем

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике нарушений активности естественных киллеров у обследуемых лиц.

Цель изобретения — повышение точности способа и ускорение анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

У обследуемого производят забор крови, выделение взвеси клеток-эффекторов в градиенте плотности, добавление к ним клеток К-562, инкубацию в среде, регистрацию гибели клеток К-562 в смеси и по величине гибели их определяют активность киллеров.

Предварительно из взвеси клеток-эффекторов удаляют макрофаги, клетки К-562 дополнительно очищают в градиенте плотности

„, SU ÄÄ 1727078А1 клетки-эффекторы смешивают с клетками мишенями К-562, дополнительно очищенных в градиенте плотности. Смесь клеток помещают в питательную среду, содержащую 0,1 — 0,2% трипановой сини и 0,5-0.6%

arapa. Соотношение эффектор:мишень соста вля ют равн ым 15 — 25:1. Клеточную взвесь в среде упомянутого состава помещают в плоский капилляр. Концы капилляра закрывают и ин кубируют в течение 4 —.5 ч при 37 С.

По окончании инкубации под микроскопом просчитывают процент прокрашенных клеток-мишеней К-562. Этот процент отражает функциональную активность киллеров. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа в 2-3.5 раза с сокращением времени анализа в 4 — 4,5 раза. центрифугированием и добавляют 80,000120.000 клеток мл до соотношения с клетками-эффекторами, равного 1;15 — 25, затем смесь клеток вносят в среду, содержащую

0,5 — 0,6% агара и 0,1 — 0,2% трипанового синего, заполняют капилляр, закрывают концы капилляра, инкубируют в течение 4 — 5 ч, а гибель регистрируют путем подсчета прокрашенных клеток.

B предлагаемом способе в качестве эффекторов используют чистую лимфоцитарную взвесь.

Пример 1. Клетки-мишени К-562 (Cataloge of cell Lihes Hybridomas), постоянно культивируемые in vitro известным образом в полной питательной среде, извлекают из нее. Перед работой суспензию К-562, взя1727078

1 тую на 2 сут после пересева, наслаивают на

Ficoll-Hypague (d = 1,077 г/см ) и центрифу з гируют при 300 xg в течение 25 мин на центрифуге ОС- = 6 М, Подобная манипуляция необходима для удаления нежизнеспособных клеток (вследствие своей повышенной плотности они оседают на дно).

В данном случае до постановки цитотоксического теста определяют процент жизнеспособных К-562, который оказался не меньше 95О/ (с помощью известного метода по исключению 0,1 -ного раствора трипановой сини). После извлечения интерфазы автоматической пипеткой в пробирку и 2-кратного отмывания клеток в питательной среде составляют клеточную суспензию (путем подсчета в камере Горячева) в концентрации 120000 кл/мл в полной питательной среде следующего состава:

Сыворотка эмбрионов коров (СЭК, коммерческая) 5мл . Глютамин 0,04 г

Гентамицин 40 мкг/мл

Среда RPMt-1640 До 100 мл

Далее проводят выделение клеток-эффекторов. Для этого кровь, взятую из вены обследуемого на гепарине в количестве 5 мл и разведенную в 2 раза средой 199, наслаивают на градиент Ficoli-Hypague (d = 1,077 г/см ) и центрифугируют при 300 в течение

30 мин при t = 20 С, Интерфазное кольцо собирают, дважды отмывают питательной средой и наносят на пластиковую поверхность, например, фирмы Flou (США), предварительно обработанную 20/-ной СЭК в полной питательной среде.

По истечении 1 ч инкубации при t = 37ОС суспензию неприлипших клеток (лимфоциты) сливают в отдельную пробирку, отмывают питательной средой, просчитывают количество лимфоцитов в камере Горячева и составляют концентрацию 1,8 10 кл/мл.

B лунки круглодонных пластин для иммунологических реакций вносят по 0,1 мл клеточных суспензий лимфоцитов и клетокмишеней К-562 в соотношении соответствен но, ра аням 15:1 (180000 клеток-эффекторов и 12000 клеток-мишеней), Пластины центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, надосадок удаляют полностью и к клеточному осадку, оставшемуся в лунках пластин, добавляют 50 мкл предварительно приготовленной смеси, которую получали следующим образом.

Брали навеску агара (Difco) в 30 мг. Добавляли к ней 1 мл полной питательной среды следующего состава:

СЭК (коммерческая) 15 мл

Глютамин 0,06 r

Гентамицин 50 мкг

Среда 199 До 100 мл выдерживали 30 мин и в водяной бане доводили смесь до состояния геля. Далее при Т геля 50 С добавляли 4,0 мл питательной среды вышеуказанного состава (0,6О/ araра), содержащей 0,005 г трипановой сини (0 1о,)

Полученную смесь с клеточным осадком осторожно ресуспендируют при 37 С, Два

5-канальных плоских капилляра длиной 1—

1,5 см и 0,25 мм опускают в приготовленную смесь (to + 37 С), содержащую клеточную взвесь, После заполнения капилляров смесью их концы закрывают пластилином или воском, капилляры помещают в чашки Петри и инкубируют при 37 С в течение 4 ч.

Параллельно проводят инкубацию контрольных капилляров, В качестве контроля выступает чистая культура К-562, помещенная в те же условия. По окончании инкубации капилляры просматривают под световым микроскопом (8 х 20). П росчитывают число окрашенных (мертвых) клеток К562 по всей длине 10 каналов 2 капилляров и рассчитывают процент прокрашенных клеток. Среднее арифметическое результатов, полученных в 10 каналах, прямо пропорционально соответствует активности киллеров.

Обсчет результатов проводили согласно стандартным методам вариационной статистики.

Разброс результатов определения активности киллеров в прототипе в соотношении 25:1 составил 9 — 64 /, т.е, более чем

7-кратный, а в предлагаемом способе — 14—

26/„т.е. менее чем 2-кратный. Точность, таким образом, в предлагаемом способе при соотношении 25:1 выше в 3,5 раза.

При соотношении 15:1 разброс в прототипе составил от 5 до 24, т.е. более чем

4-кратный, а в предлагаемом способе разброс оставил 8 — 17 /,, т.е. почти 2-кратный.

Точность, таким образом, в предлагаемом способе при соотношении эффектор:мишень 15:1 выше в 2 раза.

Таким образом, в предлагаемом способе результат цитотоксического действия ЕК фиксируется визуально, т.е, определяется глазом прямой эффект цитотоксического действия. В прототипе и аналоге этот эффект отражается косвенно либо по выходу

"Сг, либо по выходу фермента из клетокмишеней. Поэтому несмотря на объективный учет интенсивности " -излучения на счетчике радиоактивности или степени ферментативной реакции на спектрофотометре, результат предлагаемого капиллярного

1727078 6.Формула изобретения

Способ определения активности киллеров, включающий забор крови, выделение клеток-эффекторов в градиенте плотности, 25

35

45

Составитель В.Литовченко

Редактор М.Келемеш Техред М.Моргентал Корректор М.Масимишинец

Заказ 1277 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 теста будет ближе к ситуации в организме (in vivo), что повышает его точность в диагностическом плане.

Предлагаемый способ занимает значительно меньше времени (в 4 — 4,5 раза) по сравнению с прототипом. На проведение известного метода требуется 48ч, а на предлагаемый 10 — 12 ч. Это обстоятельство позволяет использовать способ при массовом обследовании населения, при этом за 1 рабочий день можно оценить NH-активность предлагаемым способом у 10 — 15 человек, а по прототипу получить результаты можно только через 2 сут. инкубацию их в присутствии клеток К-562 с последующей регистрацией гибели клеток

К-562, по количеству погибших клеток определяют активность киллеров, о т л и ч а ю5 шийся тем, что, целью повышения точности способа и сокращения времени анализа, после выделения клеток эффекторов отделяют от них путем инкубирования на пластике макрофаги, клетки К-562 перед инкубацией

10 с клетками-эффекторами дополнительно очищает центрифугированием в градиенте плотности, добавляют их в количестве

80000 — 120000 клеток/мл к клеткам-эффекторам до соотношения 1:15-25, инкубируют

15 в среде, содержащей 0 5-0,62 агара и 0 1—

0 2 трипанового синего в капилляре с закрытыми концами в течение 4-5 ч, а гибель клеток регистрируют подсчетом окрашенных клеток.