Способ получения гипотриглицеридально-активных полисахаридов

 

Изобретение относится к способу получения физиологически активных полисахаридов , которые могут найти применение в медицине. Целью изобретения является повышение активности целевого продукта. Способ заключается в том, что на бульоне Рогозы в аэробных условиях культивируют штамм Streptococcus faecium PERM BP-296 или Streptococcus faecalls PERM BP-297, или Streptococcus savlum PERM BP-298, или Streptococcus salivalls PERM BP-299, или Streptococcus olurans PERM BP-300, или Streptococcus mitis PERM BP-301, или SheptoccoccuS equinus PERM BP-302, отделяют биомассу от культуральной жидкости с последующим выделением целевого прсдукт. Получаемые полисахариды обладают способностью снижать уровень триглицерида в крови от 45 до 50%. 11 табл., 4ил. w Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (stis С 12 Р 19/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 3770904/13 (22) 26.07.84 (31) 58-135982 (32) 27.07.83 (33) JP (46) 07.05.92. Бюл, N 17 (71) Кабусики Кайся Эдванс Каихацу Кенкюдзе (J P) (72) Ясуо Каваи и Казунага Язава (JP) (53) 577.114(088.8) (56) 1. Патент СССР ¹, 929015, кл. С 12 P

19/04, 1982. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПОТРИГЛИЦЕРИДАЛЬHO-АКТИВНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ (57) Изобретение относится к способу получения физиологически активных полисахаИзобретение относится к способам получения гипоглицеридально-активных полисахаридов, т.е. полисахаридов, снижающих содержание триглицерида в крови млекопи тающих.

Вещества подобного типа действия могут быть применены в качестве терапевтических препаратов против атеросклероза или гиперлипидемии, которые являются наиболее типичными заболеваниями людей среднего и пожилого возраста.

Известен способ получения физиологически активного полисахарида путем культивирования штаммов-продуцентов из рода

Pseudqmonas на соответствующей питательной среде и выделения из ферментаци Ж 1732815 АЗ ридов, которые могут найти применение в медицине. Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.

Способ заключается в том, что на бульоне

Рогозы в аэробных условиях культивируют штамм Streptococcus faecium FERM BP-296 или Streptococcus faecalis РЕЯМ BP-297, или Streptococcus savlum РЕЯМ BP-298, или Streptococcus за!1чаИз FERM BP-299, или Streptococcus oiurans FERM В P-300, или

Streptococcus mitis FERM BP-301, или

Sheptoccoccus equlnus FERM BP-302, отделяют биомассу от культуральной жидкости с последующим выделением целевого ëðñдукт. Получаемые полисахариды обладают способностью снижать уровень триглицерида в крови от 45 до 507,. 11 табл., 4ил. онного бульона посредством фракционирования биополимеров(1). (A

Недостатком способа является недоста- Я точно высокая физиологическая активность Q0 полисахарида. " . .. а .Целью изобретения является повыше- (Я ние активности целевого продукта.

Нв фиг.1 — 4 приведены хромвтогрвммы. )с поясняющие предлагаемый способ.

Сущность способа получения гипотриглицеридально-активных полисахаридов состоит в том, что на питательной среде бульоне Рогозы — в аэробных условиях выращивают штаммы-продуценты Streptococcus

faecium FERM BP-296 или Streptococcus

faecalis FERM BP-297, или Streptococcus зач!ов BP-298, или Streptococcus заПчаНз

1732815

ГЕЯМ BP-299, или Streptococcus durans

FERM ВР-300, или Streptococcus mltls . РЕЯМ ВР-301, или Streptococcus equlnus

FERM ВР— 302 до максимального наполнения целевого продукта, отделяют биомассу. от культуральной жидкости и осуществляют выделение целевого продукта иэ культуральной жидкости или из биомассы после ее депротеинизации и дезынтеграции.

Наиболее общие примеры таких микроорганизмов сданы на хранение в Исследовательский институт ферментации (ИИФ, т,е, Международный центр хранения в соответствии с Будапештским соглашением) в

Японии, а шифры хранения перечислены в табл 1.

Микробиологические характеристики микроорганизмов, используемых в предла: гаемом способе, являются такими же, что и микробиологические характеристики известных микроорганизмов, принадлежащих тому же классу, т.е, общие микробиологические характеристики, методы культивирование и другие свойства соответствуют характеристикам, описанным в Руководстве

Бергея по определительной бактериологии, 8-е изд.

Наиболее общие микробиологические свойства указанных штаммов приведены в табл. 2 и 11.

Указанные микроорганизмы можно . культивировать известным методом. Например, бактериальные клетки могут быть получены при помощи стационарного культивирования в среде бульона Рогоза при аэробных условиях, затем бактериальные клетки отделяются при помощи центрифугирования культуры.

Состав среды бульона Рогоза следующий, г: триптиказа 1.0; экстракт дрожжей 5; триптоза 3; КгН РОа 3; КНгРО4 3; триаммоний цитрат 2; твин-80 1; глюкоза 20; хлоргидрат цистеина 0,2, кроме того, раствор соли (1 MgSO4 7НгО 11,5;

FeS04 7НгО 0,68; Мп$04 2НгО 2,4; дистиллированная вода 100 мл) 1-5 мл и дистиллированная вода — до объема 1 л, (рН

7, стерилизация нагреванием до температу. ры 121 С, которая поддерживается в течение 15 мин).

Получение полисахарида ПССТ.

Выращивание микроорганизмов.

Каждый из указанных микробных штаммов, засевают на среду бульона Рогоза и инкубируют без перемешивания при 37 С в течение 5-10 ч при азробных условиях, в результате чего получают культуральный бульон с некоторой концентрацией живых бактериальных клеток, 5

Культуральный бульон непрерывно подвергают центрифугированию со скоростью

12000 об/мин, а собранные бактериальные клетки затем промывают в соляном растворе (0,85 NaCI) 2 или 3 раза.

Разрушение бактериальных клеток.

Промытые клетки суспендируют в физиологический соляной раствор и обрабатывают термическим способом при 115ОC в течение

10 мин с целью их разрушения.

Бактериальные клетки, промытые и суспендированные в физиологический соляной раствор, разрушают при помощи обработки ультразвуком (15 кГц, 60 мин) французским прессом или.другими известными способами.

Удаление жира из клеток. Суспензию разрушенных клеток смешивают со смесью хлороформ-метанол (2:1 об/об). Компоненты, экстрагируемые органическим растворителем, затем полностью удаляются.при помощи центрифугирования со скоростью

300 об/мин в течение 10 мин, а слой хлороформа сливают.

Обработка протеолитическими ферментами. Обезжиренные пробы обрабатывают протеолитическими ферментами, такими как пронаэа, трипсин и пепсин при помощи известных процедур, Из этих протеолитических ферментов проназа является наиболее предпочтительной для этой цели. Условия обработки этим ферментом являются известными.

Очистка. В верхний слой после центрифугирования протеолитической реакционной смеси добавляют такие осаждающие агенты, как трихлоруксусная кислота или сульфат аммония с тем, чтобы протеиновая фракция выпала в осадок и ее можно было удалить. Фракцию верхнего слоя затем обрабатывают соответствующей нуклеазой или протеолитическими ферментами с тем, чтобы удалить составляющие нуклеиновых кислот, таких как ДНК и PHK или протеины фракции. После такой ферментной обработки несколько раз осуществляют диализ.

Частично очищенную фракцию затем снова подвергают другим процедурам очистки, таким как гелевая фильтрация и очистка с использованием хроматографической колонны. Чистая препарация полисахарида, обозначаемого как полисахарид ПССТ, получается в конце последней стадии.

В общем случае этот полисахарид ПССТ может быть получен в соответствии с его физико-химическими характеристиками при помощи многочисленных процедур изоляции и очистки, которые уже давно широко используются в это области техники, таких как осаждение-растворение и экстра173281 5

10

20

235 — 241 С, ее измеряют при помощи уста30 новки для измерения температуры точки плавления (модель Яанако МР-3, фирма

50 кция, экстрагирование растворителем, диализ, применение хроматографической колонны, электрофорез, гелевая фильтрация или любая комбинация этих процедур. Таким образом, изобретение никоим образом не ограничивается какой-либо конкретной из упомянутых процедур.

Т.е. препарация изобретения относится к способам получения активных продуктов, снижающих содержащие триглицеридов в крови, которые состоят из полисахарида, и их получают из микроорганизмов, принадлежащих семейству $тгертососсоэ, так как фармакологическая активность .была обнаружена во фракции полисахарида, Отметим, что активность по снижению содержания триглицерида в верхнем слое культурального бульона составляет примерно 1/5 от активности в бактериальной клетке.

Физико-химические и физиологические характеристики полисахарида ПССТ состо; ят в следующем.

Химическая природа и свойства растворимости. Тонко измельченная проба, 2 полученная после обессоливания и сушки вымораживанием, является негигроскопичным белым порошком, обладающим высокой растворимостью (-100 мг/мл) в воде, но она только частично растворяется в этаноле, метаноле и ацетоне и совсем не растворяется в простом эфире и хлороформе.

Молекулярный вес. Молекулярный вес полисахарида ПССТ оценивается в примерно 14000» 3000 и устанавливается при помощи гелевой фильтрации с использованием нескольких правовращающих материалов различного молекулярного веса в качестве индексов, и колонны Тойопеарл

HW/55 (фирма Тойосоде Ко., Лтд), уравно- 4 . вешенной при помощи 25 мМ трис-HCl буфера, содержащего 0,3M NaCl (рН 7,5), Удельный показатель вращения.

Удельный показатель вращения упомянутого полисахарида ПССТ в 1,8%-ном 4

ХУ растворе, (а)р, равен + 190,1. (правое вращение). Этот показатель определяется при помощи поляриметра (модель ДИП-4, фирма Джапан Спектроскопик, Ко, Лтд.), Сахарный состав. 4 мг пробы обрабатывают 0,2 М раствором ТФК (трифторуксусной кислоты) при 100 С в течение 7 ч, а триметилсилилирование осуществляют следующим образом: пробу смешивают с 0,2 мл гексэметилдисилазана (20 % в пиридине) и 5

0,02 мл триметилхлорсилана, смесь перемешивают в течение 15 мин и после отстаивания в течение 5 мин подвергают газовой хроматографии.с целью определения содержания глюкозы, рамнозы и т.д. Температура колонны разделения составляет 179 С. Содержание уроновой кислоты определяют с использованием метода карбазол-Н2$04 (модифицированный метод Биттера-Муира).

Состав сахаров полисахарида ПССТ следующий, %: глюкоза 70,3; рамноза 13,7; уроновая кислота 16,0.

Кислотно-основные характеристики. рН 0,1 и 0,5%-ного раствора полисахарида

ПССТ составил 6,71.

Спектр инфракрасного поглощения.

Инфракрасный спектр поглощения полисахарида ПССТ, полученный с.использованием инфракрасного спектрометра (модуль IASl 0 А 302, Джапан Спектроскопик Ко, Лтд), приведен на фиг.1,где по осям абсцисс и ординат отложены длина волны и пропускание соответственно, Элементарный анализ. Элементарный анализ при помощи элементарного анализатора (модель 240 В, Перкин-Элмер) дал следующий результат: С 37,2%, H 6,4% и О

56,4%, для полисахарида ПССТ, Упрощенная формула имеет следующий вид

С31Н64Н35.

Температура точки плавления. Точка плавления полисахарида ПССТ составила

RBHBI MMoTo Сейсакушо, Япония).

Физиологические характеристики, Полисахарид ПССТ-является активным при применении с целью снижения содержания триглицерида в крови млекопитэющего при стоматическом применении.

Эта активность является стабильной в области температур от -80 С до 115 С и при рН в области от 4,1 до 11, если даже полисахарид перед применением хранился.

Фармакологическое действие палисахарида ПССТ, Фармакологические эффекты. Предлагаемый антиэтеросклеротический препарат, содержащий предлагаемый полисахарид

ПССТ, является в высшей степени эффективным при снижении содержания триглицерида в крови млекопитающих. В соответствии с этим предлагаемый препарат используется в качестве терапевтического или профилактического препарата при заболеваниях, связанных с атеросклерозом, гиперлипидемией,. гиперлипопротеиномией, ксантоматозом, холецистолитизом, гипертонией, диабетом и другими заболеваниями.

Предлагаемая композиция может быть применена к млекопитающим стоматическим, внутрибрюшинным внутривенным или любым другим способам. Количество

17328!5 препарата в одной дозе должно составлять от примерно 1 мг до 0,5 г/кг веса тела. При

- стомэтическом применении в предпочтительном варианте это количество в одной дозе составляет от примерно 0,01 мг до 5

100 мг/кг веса тела. Для применения лекарственного препарата может быть выбрана любая его форма: его можно применять в виде раствора в физиологическом соляном растворе или в других носителях, в виде 10 инъекций, изготовленных при помощи лиофилизации и т.д., в виде суппозиториев, таблеток с покрытием, гранул, таблеток, капсул и т.д. с соответствующими носителями и .разбавителями. 15

Острая токсичность. Указанная величина для предлагаемого полисахарида ПССТ составляет более 1200 мг/кг веса тела при, внутрибрюшинном применении мышам, Предлагаемый материал является по суще- 20 ству нетоксичным при стоматическом применении.

Пример 1, Получение и очистка полисахарида ПССТ. Streptococcus faeclum

ФЕРМ БП вЂ” 296 прививают в 2 л среды 25 бульона Рогоза с конечной концентрацией клеток 1х10 бактерий/мл. Среду после прививки культивируют в течение 10 ч при 37 С без перемешивания в аэробных условиях с тем, чтобы в результате получить 30 культуоальный бульон с концентрацией клеток 10, бактерий/мл. Бактериальные клетки собирают при помощи непрерывного центрифугирования со скоростью 12000 об/мин, промывают физиологическим соляным рас- 35 твором (0,85 NaCI) и суспендируют s такой раствор с тем, чтобы получить 100 мл суспензии клеток с концентрацией 2х10 бактерий/мл.

Упомянутую суспензию бактериальных 40 клеток обрабатывают при 115 С в течение

10 мин и обрабатывают 3 раза смесью хлороформ-метанол (2:1 в/в) с целью удаления жиров.

Обезжиренную суспензию бактерий 45 подвергают центрифугированию со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин, а нижний слой, т.е. слой хлороформа, удаляют.

Водный слой используют в качестве исходного материала на следующих стадиях очи- 50 стки;

Исходный материал затем обрабатывают 20 мг проназы (сигма протеаза типа XIY) в 100 мл фосфатного буфера (рН 7,8), содержащего 0,0015 мг СаС!2, при 47 С в течение 55

24 ч, а затем обрабатывают при помощи

10 мг проназы при тех же условиях.

Материал, обработанный проназой, разделяют на осажденную фракцию и фракцию верхнего слоя после отстаивания при помощи центрифугирования со скоростью

3000 об/мин в течение 10 мин, Во фракцию верхнего слоя добавляют

1/9 объема 100 -ного (в/о) раствора трихлоруксусной кислоты (ТХК), выдерживают при 4 С в течение 3 ч при перемешивании, э затем полученный материал подвергают центрифугированию при скорости 3000 об/мин в течение 10 мин, в результате чего получают осадок и верхний слой, В осажденную фракцию добавляют такой же объем 10 -ного раствора TXK и повторяют описанную процедуру, Полученный верхний слой промывают 3 раза этиловым простым эфиром с целью удаления ТХК, растворяют в 50 мл дистиллированной воды, нейтрализуют 1 н. раствором NaOH, диализируют с целью полного удаления ТХК и, наконец, подвергают его лиофилиэации с тем, чтобы получить 258 мг (сухой вес) фракции верхнего слоя, Полученную фракцию верхнего слоя обрабатывают проназой, .подвергают диалиэу, в результате чего получаю т 176 мг (сухой вес) диализированной фракции (MB

3500), Диализированную фракцию в даль нейшем будем называть очищенной фракцией I.

Очищенную фракцию I подвергают фракционированию при помощи хроматографической колонны Сефадекс-Г-100 (фирма Фармациа), урвновешенной буфером

0,05 М трис-HCI. Полученная в результате хроматограмма очищенной фракции при скорости элюирования 1 мл/мин, приведена на фиг,2, где по абсциссе откладывают объем элюирования, а по оси ординат — концентрацию злюированного материала. ,Фракцию после 124 мл собирают и в дальнейшем будем ее называть очищенной фракцией ll (сухой вес 93,6 мг).

На фиг.3 — приведена хроматограмма очищенной фракции il, которая была получена при помощи колонны Тойопеарал HW—

55F, уравновешенной 25 мМ буфера трисHCI, содержащего 0,3 M NaCI.

Скорость элюирования составила 1 мл/мин, На фиг.3 кривые 1 — 3 представляют собой профили элюирования сахара, протеина и нуклеиновой кислоты соответственно.

Очищенный полисахарид ПССТ(87,9 мг сухой вес) выделяют при помощи отбора порции, элюированной в области фракций

80 100 мл.

На фиг.4 приведена хроматограмма полисахарида ПССТ при тех же эспериментальных условиях, которые были использованы для фиг.3.

В табл.3 приведен количественный выход протеина, который определялся ме1732815

5

15

5S тодом Лоури. РНК, который определялся методом орсинола, ДНК, который определялся методом дифениламина, и сахара, который определялся методом фенола-HzS04 в каждом способе получения.

Удельная активность, приведенная в табл.3, указывает на относительную активность по снижению содержаний триглицерида каждой фракции при испытании на крысах на единицу веса, причем активность термически обработанных бактериальных клеток равна 1. Методы анализа по определению активности снижения содержания триглицерида у животных описаны в примере 2.

Установлено, что полисахарид ПССТ может быть выделен и очищен из других бактериальных штаммов, перечисленных в табл.1, по аналогии с настоящим примером, но с меньшим выходом, Пример 2. Фармакологический эффект полисахарида ПССТ.

Активность по снижению содержания триглицерида.

1. Пробы физиологического раствора, содержащие эквивалент 16 мг/кг веса тела лиофилиэованного полисахарида ПССТ, получают аналогичным образом. Эти пробы применяют стоMàòè÷åñêèì способом в ежедневной дозе 1 мл в крысам (возраст 18 недель, самцы, средний вес 246 г, 10 крыс в группе) и стерильным мышам (возраст 18 недель, самцы, средний вес тела 30 г, 10 мышей в группе). Крысы и мыши вскармливаются в течение 8 — 12 недель. Затем собирают артериальную кровь из абдоминальной аорты этих животных, а пробы сыворотки отделяют при помощи центрифугирования всей крови. Определяют содержание триглицерид ТГ ВАКО (фирма Вако . Ю нивке Ко, Лтд. Ацетил-ацетоновый метод).

Полученные рузультаты собраны в табл,4 (степень снижения-по сравнению со значениями в контрольных группах, к которым описанная обработка не применялась), Состав диеты, которая применялась на период вскармливания, приведен в табл.5.

2. Упомянутые пробы применяют орально стоматическим способом в ежедневной дозе 1 мл к обычным крысам (возраст 18 недель, самцы, средний вес животного 238 г, 15 крыс в группе) и к обычным стерилизованным мышам (возраст 18 недель, самцы, средний вес животного 31 г, 10 мышей в группе) в течение 4 недель. Содержание триглицерида в крови определяют в точности так же, как это было описано. Полученные результаты собраны в табл.б (степень снижения по сравнению со значениями, полученными для необработанной контрольной группы).

3. Физиологические соляные пробы, содержащие 4 мг/мл полисахарида ПССТ, применяют стоматическим способом в ежедневной дозе 1 мл на крысу в течение 2 недель к крысам, больным гиперлипидемией (возраст 18 недель, самцы, средний вес животного 250 г, 5 крыс в группе). которых вскармливают кормом, богатым холестерином. Содержание триглицерида в крови определяется в соответствии с приведенным описанием. Результаты собраны в табл,7.

Реакция на различные дозы. Физиологические соляные пробы, содержащие от 0,1 до 20 мгlмл полисахарида ПССТ, применяют стоматическим способом в ежедневной дозе 1 мл на обычную крысу (возраст 6 недель, самцы, средний вес животного 216 г, 5 крыс в группе) в течение 4 недель. Содержание триглицерида в крови определяют указанными методами (в качестве контрольной группы использовалась группа необработанных крыс). Полученные результаты собраны в табл.8.

Острая токсичность. Физиологические соляные пробы (0,5 мл/мышь), содержащие

1,10 и 100 мг полисахарида ПССТ, применяют внутрибрюшинным способом к мышам 1С (возраст 6 недель, средний вес

31,6+0,6 r, 10 животных в группе). Танатобиологические наблюдения за мышами осуществляют в течение 14 дней. Контрольным материалом был физиологический соляной раствор.

Величина 05о, рассчитанная в соответствии с методом Беренса-Кербера, составила более 1200 мг/кг веса животного. При стоматическом применении предлагаемый материал является по существу нетоксичным, Фармацевтические композиции, 1. 25 мг очищенного полисахарида

ПССТ тщательно перемешивают с 275 мг порошка очищенного крахмала, а затем иэ . полученной смеси изготавливают таблетки для стоматического применения. Каждая полученная. таким образом таблетка соответствует дозе в 10 термически обрабо1 танных клеток/кг веса тела для взрослого пациента, имеющего вес в 50 кг.

2. Полисахарид ПССТ тщательно перемешивают с раэбавителями, такими как карбонат кальция, лактоза и т.д., смазывающими материалами, такими как стеариновая кислота, тальк и т.д, и другими добавками, а затем из полученной смеси получают таблетки для стоматического применения. Ежедневная доза полисахарида

1732815

ПССТ в общем случае составляет от 01, до

100 мг/кг веса тела.

-3. Полисахарид ПССТ-(900 мг) суспендируют и растворяют в дистиллированной воде (30 мл), добавляют ароматизирующий сироп, а затем приготавливают композиции в виде сиропа.

Пример 3. Получение и очистка ÒÐ5полисахарида.

$ЛаесаИз FERM BP-297, S avlum FERM

BP-298, S. sativarlus РЕЯМ ВР— 299, S.durans FERM BP-300, $.mltis FERM BP301, $.equlnus РЕЯМ BP — 302 инокулируют в бубьон Рогоза (2 л) при конечной концент° рации 1х10 бактерий/мл. Засеянную среду инкубируют в течение 10 ч при 37 С беэ перемешивания при аэробных условиях до получения 10 бактерий/мл культурального, бульона. Затем бактериальные клетки собирают при помощи непрерывного. центрифугирования при 12000 об/мин, промывают физиологическим раствором (0,85% NaCI) и суспендируют в том же растворе до получения 100 мл суепензии клеток при концентрации 2х10 мл.

Указанную бактериальную клеточную суспензию подвергают тепловой обработке при 115ОС в течение 10 мин и трехкратной обработке смесью хлороформа и метанола (2:1 об/об) в целях удаления жиров.

Обезжиренную бактериальную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин и нижний слой, т.е. слой хлороформа, отбрасывают. Водный слой используют в качестве исходного материала в последующей стадии очистки. Затем исходный материал обрабатывают 20 мг проназы (сигма проказа типа XIV) в 100 мл фосфатного буфера (рН 7,8), содержащего 0,0015 мг

CaClz, в течение 24 ч при 47 С, а затем при тех же условиях обрабатывают 10 мг проназы.

Обработанный проназой материал разделяют на фракции преципитации и супернатанта путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Во фракцию супернатанта добавляют 1/9 объема

100 мас.%-ной трихлоруксусной кислоты (TCA), оставляют с перемешиванием на 3 ч при 4 С, а затем центрифугируют при

300 об/мин в течение 10 мин для получения фракции преципитации и супернатанта.

Фракцию преципитации дополняют тем же объемом 10% ТСА и повторяют указанную процедуру, Полученный супернатант 3 раза промывают этиловым эфиром для удаления

ТСА, растворяют в 50 мл дистиллированной воды, нейтрализуют 1н. NaOH, диалиэуют с целью полного удаления ТСА и, наконец, лиофилизуют для получения фракции супернатанта.

Полученную фракцию супернатанта обрабатывают проназой описанным способом и диализуют для получения диалиэированной фракции (MW > 3500), Указанную очищенную фракцию фракционируют при помощи хроматографии на колонках с .Сефадексом С-100, уравновешенным 0,05 М трис-НС1 буфером.

Очищенный TPS полисахарид выделяют путем сбора элюированной части в 80100 мл фракций.

Выход полисахаридов приведен в табл.9.

Физико-химические свойства TPS полисахарида являются такими же, как описанные.

Пример 4, Фармакологический эффект TPS полисахарида.

Указанные образцы были введены перорально при дневной дозе 10 мг/день/крыса стандартным крысам (самцам в возрасте 18 недель со средним весом 238 г, каждая группа содержала 15 крыс). Кровь животных анализировали на уровень триглицерида.

Степень снижения триглицерида приведена в табл.10.

Формула изобретения

Способ получения гипотриглицеридально-активных полисахаридов предусматривающий выращивание штамма-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли, биостимуляторы роста и воду, в аэробных .условиях до. максимального накопления целевого продукта, отделение биомассы продуцента с образованием потока культуральной жидкости и последующее выделение и очистку целевого продукта с его депротеиниэацией, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве штамма-продуцента используют штамм S.faeclum FERM

BP-296 или $ faecalls FERM BP-297, или

S.savlum РЕЯМ BP-298, или S,sallvalls

FERM BP-299, или S.durans FERM ВР-300, или $.mltls FERM BP-301, или S,equinus

РЕЯМ BP-302, в качестве питательной среды — бульон Рогозы, а выделение целевого продукта проводят из культуральной жидкости или из биомассы после ее депротеинизации и дезинтеграции.

1732815

Таблица 1

Таблица 3 фракции

Содержание компонентов, мас.3

Удельная активность

РНК . ДНК . Сахар

Белок

23,2 1

2000

5,8

Следы

Следы

Полисахарид

11одвергнутые тепловой обработке клетки

Всплывающий слой

Очищенная фракция I

Очищенная фракция II

Выход, мг (сухой вес) 258

176

93,6

87 ° 9

31,9

14,1

2,8

2,1

34,8

1,8

1,6

0,9

Следы

76,3 7,1

95,6 - 10,2

97,0 12,3.

100 23,0.

«ьв

Таблица 4 с

Таблица 5

16

Таблица б

* Диета, обогащенная холестерином (добавление 1 холестерина в указанную диегу)

** Диета, обогащенная фруктозой (замена фруктозой всего количества пшеничного крахмала в указанной диете)

Таблица 7

Таблица 8

Таблица 9

Таблица 10.

1732815

18

Т а б л и ц а . 1

Характеристика

Штаммы FERN

Форма клетки

Размер клетки

Соединение

Сфероид

0,5-1,0 мк в диаметре

Пары или цепи в жидкой среде

Подвижность

Образование эндоспор

Каталаза

Оксидаза

Краситель по Граму

Гемолиз

Рост: при 10 С при 45 С при 50 С

Оптимальная температура для роста, С

37

37

Теплоустойчивость при

60 С в течение 30 мин

Рост в культурной среде при рН 9,6

Способность восстанавле ния метиленового голубого

Потребность в СО

Разжижение желатина

Рост в культурной среде, содержащей:

NaC1 (6,5X) (403) 1

++

Продуктивность аммиака

Гидролиз гиппуровой кислоты

Рост в культуральной среде, содержащей теллурит

ТТС

О/О/К/

Фекалии человека

Источник

2,3,5-Трифенилтетразолхлорид.

Не производилось.

Глюкоза

Эскулин

Чнулин

Лактоза

Глицерин

Арабиноза

Иелецитоза

Сорбит

Антигенная группа

ВР-296 ВР-297 ВР-298 ВР-299 ВР-300 1 BP-301 ) ВР-302

1732815

"23

f00

И00;, ЛИ

ЙЯйа Ьмны, сн

Rue. 1

10Ю (Овею зпаирс3аноя, es: юг, Р

Ьь

Ъ р . 3

Ъ ф+

16, О, f5,0,: 250, 1732815

200

1 1

I .!

0 " И N8

GAepr зпиирв5анцн, ни

@АХ

800

100

Я йЮ

РАЙ зятуа3анм, w . юг. 4 .

Составитель О. Скородумова

Техред М.Моргентал Корректор Т. Палий

Редактор С. Пекарь

Заказ 1592 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101