Способ получения экзополисахарида

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 19/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4647068/13; 4647067/13 (22) 04,01.89 (46) 15,12.91. Бюл. N 46 (71) Ладыжинское производственное биофармацевтическое объединение "Энзим" и

Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) В.B.Äåðÿáèí, Л,А.Старухина, Т,Д.Чистова, А.А.Бузин, Т.Ю.Матюхина, С.B,ßðoöкий, В.А.Балаховская, Л.Н.Шинкаренко, В.П.Сойченко, B,В,Балаховский, В.M.Áîéцун, И,Н.Игнатьева, P,Í.Áeëoaa, Е.В,Глухова, Б.А. Шендеров, Н. Б, Марты н юк, B,Ä.Èâàíîâ и Н.М.Подгорная (53) 577,114(088.8) (56) Патент Франции N. 2551070, кл. С 08 В 37/00, 1985. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть

Изобретение относится к микробиологической промышленности, биотехнологии и может найти применение при получении высокоочищенных препаратов зкзопалисахаридов (ЭПС), отличающихся способностью к образованию прозрачных высоковязких гелеобразных растворов для использования в парфюмерно-косметической промышленности, медицинских и пищевых целях, фармацевтике.

Наиболее близким к изобретению является способ обработки ксантана для увеличения его вязкости и фильтруемости.

Недостаткам этого способа является

- его неэффективность для культуральнай жидкости В.pc lymyxa В-3015, недостаточная прочность растворов и отсутствие гепеообразующих свойс1B.

„„5 3 „„1698293 А1 применено при получении высокоочищенных препаратов зкзополисахаридов. Цель изобретения — увеличение прозрачности растворов зкзополисахарида, а также увеличение их тиксотропности. Культуральную жидкость Bacillus polymyxa ВКПМ В-3015 подвергают сушке на распылительной сушилке при температуре сушильного агента на входе 105-115 С с последующим диспергированием полученного порошка в воде, нагреванием дисперсии до 80 — 100 С в течение 25-35 мин, последующим сепарированием смеси и выделением целевого продукта из жидкой фазы спиртом или путем ультрафильтрации. Для повышения тиксотропности после сепарирования раствор подщелачивают до рН 12,0 и выдерживают

25-35 мин при 80-100 С с последующей нейтрализацией раствора и выделением целевого продукта осаждением спиртом, 1 з.п, ф-лы, 3 табл.

Целью изобретения является увеличение прозрачности растворов зкзополисахарида, а также увеличение их тиксотрапносги.

Сущность изобретения заключается в том, что используют культуральную жидкость В,polymyxa ВКПМ В-3015, коагуляцию клеток в ней осуществляют путем распылительной сушки при температуре сушильного агента на входе 105 — 115 С, полученный порошок диспергируют в воде, нагревают дисперсию до 80 — 100 С, выдерживают в течение 25 — 35 мин, сепарируют смесь и выделяют целевой продукт из жидкой фазы осаждением спиртом или ультрафильтрацией, С целью увеличения тиксотропности растворов ЭПС после сепарирования раствор подщелачивают да рН 12,0 и выдерживают 25 35 мин пр 1 80 100 С с

1698293

55 псследующей нейтрализацией раствора с выделением целевого продукта осаждением спиртом.

Способ осуществляют следующим обра3оМ.

Кул ьтурал ь ную жидкость В. poly myxa, полученную при ферментации на гидролиз ванном крахмале и содержащую 20 г

Э С/г, разбавляют водой в 2 раза и сушат н распылительной сушилке (температура в здуха на входе 105 — 115 С, а на выходе—

5,-60 С). Полученный порошок диспергируют в воде до концентрации 1-2% при пер мешивании и нагревании до 45 С до п >лучения однородной дисперсии и исчезн >вения комков. Затем полученный раствор в !держивают в течение 25-35 мин при 80100 С, образовав ш ийся осадок отдел я ют с ьпарированием или центрифуги рованием

P =60 С). Из прозрачного фугата выделяю

ЗПС осаждением спиртами или получают

1% "íûé концентрат с помощью ультрафильтрации. Для получения гелеобразующего полисахарида и увеличения тиксатроп ности его растворов прозрачный фугат, полученный после сепарации и центрифугиравания, выдерживают в течение 25 — 35 мин при рН

1 2 (10% ИаОН) и температуре 80 — 100" С.

После охлаждения раствор нейтрализу фт 6 н, Н2504 кислотой и осаждают ЭПС г!еремешиванием рас...-.opa с изо-прапанаг!ом или 3TBHofloM B сает lolllGHMM 1:1,5 соот аетственно. Образовавшийся осадок промывают свежей порцией этанала и сушат в вакуумной или конвекционной сушилке при 40 С, Пример 1, Посевную культуру

В,polymyxa (10 об,%) вносят в питательную

Среду, содержащую, об.%: гидролизаванный кукурузный крахмал 3; БВК0,5; КН2Р04

0,05;,К2НРО4 3Н20 0,05, M 04 1Н20 0,04, СаС!2 0,02, Питательная среда должна иметь следующие показатели; рН 7,1 +. 0,3; температура 28,2 +. 2 г/л, концентрация

РВоьщ. 28 +. 2 г/л, концентрация РВ . -,.-a менее 9ч- 1 г/л, концентрация аминного азота 0,16 +. 0,02 г/л, концентрация белка

3,0 +. 0,5 г/л, отсутствие посторонних жиВых микроорганизмов.

Процесс микробиологического синтеза проводят в аппарате с рабочим объемом 100 дм при 28 +- 1ОС, рН 7,1++ 0,3, >давлении в аппарате 0,45 ". 0,5 кгс/см, аэрации

0,55ч 0,05 м воздуха/мз среды в мин, ска з рости перемешивания 196 об/мин. Содержание ЭПС в полученной культуральной жидкости 18 гlл.

Г! р и м е р ы 2-17. l0 дм культуральной

:3, жидкости В,Ро!угпуха полу анной как апи5

20 и

45 сана в примере 1, разбавляют водой до 20 дм и сушат на распылительной сушилке при температуре сушильного агента на входе 100-125 С, Порошок (500 г) растворя эт при перемешивании в 25дм воды, нагоеваз ют до 70-100 С и выдерживаю1 гри этой температуре в течение 20-40 мин. Образовавшийся осадок отделяют сеггарированием, Фугат смешивают с этанолом (или изопрапанолом) в соотношении „ 1,5, образовавшийсяся осадок 3 П С отдел я аr, промывают этаналом и сушат в вакууме; для получения ЭПС в виде конценграта фугат ультраконцентрируют да содержания ЭПС

1%, Для получения гелеобразующего ЗПС фугат подщелачлвают да рН 10-13 л выдер>кивают при 70-100 С в течение 20-40 мин.

После охлаждения до 25-30 С раствор нейтрализуют 6 н. Н2804 кислотой, К раствору приливают иэопропанол (a соотношении

1:1,5), промывают этанолом и сушат в вакуумной или конвекционной сушилке.

Из- полученных препара ов сухих зкзопалисахаридов (170 — 189 г) готовят 1%-ный раствор и определяют параметры дисперсности: мутность г(см 1), вязкость >> дин (Па с}, тиксатропность, Эти же параметры определяют для 1%-ных концентратов ЗПС, Л р и м е р 18, 1 дм культуральной жидкости В.polymyxa, полученной как описано в примере 1, разбавляют в 2 раза водой, нагревают до 140ОС и выдер>кивают пои данной температуре 30 мин. Получсннь|й осадок отделяют сепарированием или центрифугированием а тех же условиях, что и в примерах 2 — 17. Далее фугат обрабатывают аналогично примерам 2 — 17.

Пример 19. 1 дмз культуралы-:ой жлдкости В.polymyxa, полученной ка: описано в примере 1, разбавляют в 2 раза водой, нагревак>т до 100 С и выдерживают при данной температуре и рН 5,5 в течение

15 мин, Далее центрифугируют и осаждакн супернатант изопропанолом в соотношении 1;2 соответственно, Осадок полисахарида отделяют на фильтре и сушат в вакууме

40оС

Пример 20, Культуральну,о жидкость

Âañ.polymyxa обрабатывают аналогично описанным примерам. Порошок, полученный после распылительной сушки 500 г, растворяют.при перемешивании B 25 дм воды и выдерживают при 90 С в течение 30 мин.

Образовавшийся осадок отделяют сепарированлем. Фугат концентрируют на ультрафильтр"-,ционной установке БТУ-1 до концентрации ЭП 1%. Этот концентрат ана" .! 8293 лизируют на вязкость и мутнос1ь:,;ин.вязкость f/0,86 Па с, мутнасть т = 0,381"., 1/а.:,,.При нагреве в течение 35 мин р= 0,876

Па. с, r =- 0,365 1/см. Вязкость проверяют на ротационноМ вискозиметре РЕОМАТ- :0ч..

Данные экспериментов представлены в табл.1, Как видно из табл.1 (примеры 2 — 7), использование сушильного агента с температурой на входе ниже 105 С приводит к 10 образованию влажных комков в результатс склеивания частиц, что дает резкое увеличение мутности (т ) и, следовательно, уменьшение прозрачности растворов. При этом существенно увеличивается время раство- 15 рения препарата полисахарида и несколько уменьшается вязкость раствора. Увеличение температуры сушильного агента выше

115 С нецелесообразно, так как время растворения и мутность раствора препарата 20 при этом не уменьшаются, а вязкость раствора не увеличивается, но возрастает расход энергии на нагрев сушильного агента.

Сокращение времени нагрева раствора до 20 мин (примеры 8 — 12) приводит к недо- 25 статочной коагуляции клеток продуцента в растворе, что затрудняет их дальнейшее отделение, Растворы, образующиеся из Конечного продукта, имеют небольшую вязкость и большое значение параметра 30 (пример 8). Увеличение времени нагрева да

40 мин также нецелесообразно, так как не приводит к улучшению показателей вязкости и прозрачности (примеры 1", 12).

Уменьшение температуры нагрева рас- 35 твора ниже 70 С ухудшает эффективность коагуляции клеток продуцента в растворе, а увеличение ее выше 85 С лишь незначительно улучшает показатели ти ц дин, раствора конечного продукта и не оправдывает 40 энергозатраты, Все препараты обладали практически мгfloBBHHOA тиксотропностью (не более 3 с).

В табл.2 представлены значения параметров дисперсности (мутности тсм1; чис- 45 ла дисг;ерсных частиц N, см ; массовой -з, концентрации дисперсных частиц С, г/см; радиуса дисперсных частиц г, мкм) pBGTBQ" ров различной концентрации; пектина яблочного (фармахим); ксантана (Sigma); -50 полисахарида В.ро(углуха, полученного по предлагаемому способу.

Наименьшее значение т имеют растворы В.polymyxa при всех рассмотренных концентрациях, при этом значения г раствора:

В.polymyxa на порядок ниже, чем у ксантана и пектина. Мутность(т) растворов полисаха, ",цо; B.polymyxa в отличие от ксантана и пектина увеличивается крайне медленно с ростом концентрации полимера в растворе, ;та yêàçûâàåò на хорошую растворимость первого в воде, Концентрация диспергиро .энного (нерастварившегося) вещества (С) у палисахаридов В.polymyxa на порядок ниже, чем у ксантана и пектина. Размер частиц диспергированных полимерных агрегатов

В polymyxR в растворе меньше, а их число больше, чем у ксантана и пектина.

Растворы ЭПС (пo примеру 5), полученные после сепар .равания, выдерживают в течение 20 — 40 мин пои 70-100 С при рН

10 — 13. Полученные результаты представлены в табл.3, Эффективность обработки контролируют па динамической вязкости

1/--ных растворов и их тиксатропнасти.

Так,м образом, оптимальными параметрами щело oA обработки являются рН

12,0 температура 90 С, время выдержки 30 мин, Формула изобретения

1. Способ получечия зкзапалисахарида включающий каагуляцию клеток в культуральной жидкое. и и их отделение, а т л и ч аю гц и и с я тем, что, с целью увеличения прозрачности растворов экзопалисахарида, используют культуральную жидкость

Вас! Низ poiymyxa ВКПМ В-3015, коагуляцию клеток в ней осуществляют путем распылительнай сушки при температуре сушильного агента на входе 105 — 115 С, полученный порошок диспергируют в воде, нагревают дисп ..рсию. до 80=100ОС, выдерживают в течение 25 — 35 мин, сспарируют смесь и выделлют целевой продукт из жидкой фазы осаждением спиртом или ультрафильтрацией.

2. Способ пап,1, отл ича ющийся тем, что, с целью увеличения тиксотропности растворов экзополисахарида, после сеи: пирования раствор подщелачиваютдо рН

1",0 и выдерживают в течение 25 — 35 мин г ри 80-100 С с последующей нейтрализацией раствора с выделением целевого продукта осаждением спиртом, 169В293

Температура раствора, С

Время нагрева раствора, мин

Время растворения полупродукта, мин

Температура сушильного агента на вхо е,С

Пример

Тиксотропность, с

0,834

0,541

0,418

0,415

0,416

0,870

0,885

0,894

0,890

0,890

2

2

3 "рН 5,5.

3

5

7

9

11

12

13

14

16

18

19"

11

1л5

115

ЗО

ЗО

14Î

100

ЗО

Таблица1

Вязкость Мутность, дин., Па с см

Таблица? "."";. 0" 93

Продолжение табл.3 иСоставитель В.Дерябин

Редактор T.Ëàçoðåíêî Техред M.Mîðãåíòàë Корректор H. Ревскэя

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4368 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рэушская наб., 4. 5