Способ отбора высокотриптофановых генотипов кукурузы

 

Использование: биотехнология, сельское хозяйство, биохимия растений, селекция и семеноводство. Сущность изобретения: облучают исследуемый образец зерна кукурузы ультрафиолетовым светом , определяют спектр флуоресценции, находят максимум флуоресценции и по его положению в интервале длин волн 326-330 нм идентифицируют высокотриптофановые формы. 1 з.п.ф-лы, 6 табл. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А 01 Н 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4875486/13 (22) 22,10,90 (46) 23,06,92. Бюл, М 23 (71) Днепропетровский государственный университет им,300-летия воссоединения

Украины с Россией (72) В.С.Феденко, В.С.Стружко и В.В.Глуш.ко (53) 631.023.46 (088,8) (56) 1. Палий А.Ф. Генетические аспекты улучшения качества зерна кукурузы. — Кишинев: Штиинца, 1989, с.б2.

2. Методы . биохимического исследования растений./Под ред. Ермакова А.И. — Л.:

Агропромиздат, 1987, с.277-279.

3. Цариченко А.П. Селекция на качество белка в зерне пшеницы, кукурузы, ячменя.—

Краснодар, НИ ИСХ, 1977, вып,12, с,116-126.

Изобретение относится к биотехнологии, к генетическим исследованиям зерновых культур и может быть использовано в селекции и семеноводстве для отбора перс- пективных форм кукурузы с улучшенным качеством зерна, Кукуруза является одной из основных зернофуражных и пищевых культур, Однако, наряду с высокой продуктивностью кукурузы, ее зерно отличается несбалансированностью аминокислотного состава. Одним из показателей. снижающих питательную ценность зерна кукурузы, является низкое содержание триптофана, В связи с этим большую практическую значимость приобрели селекцион но-генетические приемы улучшения качества зерна кукуруэы путем повышения содержания

„„5U ÄÄ 1741676 А1 (54) СПОСОБ ОТБОРА ВЫСОКОТРИПТОФАНОВЫХ ГЕНОТИПОВ КУКУРУЗЫ (57) Использование: биотехнология, сельское хозяйство, биохимия растений, селек ция и семеноводст во, Сущность изобретения: облучают исследуемый образец зерна кукурузы ультрафиолетовым светом. определяют спектр флуоресценции, находят максимум флуоресценции и по его положению в интервале длин волн 326-330 нм идентифицируют высокотриптофановые формы. 1 з.п,ф-лы, 6 табл. триптофана (1), С решением этой важной задачи неразрывно связана разработка способов отбора перспективных селекционных 4 форм кукурузы с повышенным содержанием Ф триптофана в зерне. и

Известны способы отбора, включающие ( проведение щелочного или ферментативного гидролиза образца муки, обработку пол- ( ученного гидролизата цветореагентом, измерение оптической плотности окрашенного раствора, определение количественного содержания триптофана по калибровочной зависимости и проведение отбора форм кукурузы с улучшенным качеством зерна в сравнении с контролем (2).

Недостатки указанных способов — длительность процедуры гидролиза образца муки, трудоемкость проведения анализа с

1741676

20

40

55 использованием большого набора дефицитных и токсичных химических реагентов, Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий гидролиз образца муки под действием проназы, обработку гидролизата раствором и-диметиламинобензальдегида, измерение оптической плотности окрашенного комплекса с последующим отбором высокотриптофановых образцов по результатам анализа, Согласно способу навеску образца муки (500 мг) смешивают с суспензией фермента проназы при рН 7,4 (значение рН поддерживают прибавлением насыщенного раствора бикарбоната натрия). Гидролиз проводят в течение 48 ч при 37-390С в термостате параллельно для анализируемого, контрольного образцов и суспензии фермента (контроль фермента). Гидролизаты охлаждают и центрифугируют в течение 30 мин, К пробе гидролиэата прибавляют 5 g,ный раствор и-диметиламинобензальдегида в концентрированной соляной кислоте, 1 Д-ный раствор нитрита натрия и выдерживают 15 мин, Окрашенные растворы фильтруют и Определяют оптическую плотность на фотометре для исследуемого образца, контроля образца и контроля фермента. Количественное содержание определяют по калибровочной зависимости, полученной путем анализа стандартных растворов триптофана. Отбор высокотриптофановых форм кукурузы проводят в сравнении с контрольным образцом зерна (3) Недостатки известного способа-длительность проведения гидролиза образца муки(2 сут). необходимость поддержания в процессе гидролиза установленной температуры и величины рН, использование в процессе анализа растворов реагентов в концентрированной соляной кислоте, что существенно ограничивает применение способа для массовой оценки селекционного материала и не дает возможности проведения экспресс-диагностики.

Целью изобретения является упрощение и ускорение отбора.

Способ осуществляется следующим образом, Срез зерна или муку образца кукурузы помещают в кювету спектрофлуориметра, облучают ультрафиолетовым светом при длине волны 270-285 нм,, измеряют спектр флуоресценции образца в области 290-360 нм и определяют положение максимума флуоресценции. При положении максимума в интервале длин волн 326-330 нм проводят отбор высокотриптофановых образцов кукурузы;

Интервал значений длин волн возбу>кдения (270-285 нм) и флуоресценции (326330 нм) обоснован экспериментально, Отличительной особенностью способа является использование в качестве образца среза зерна или размолотого зерна кукурузы и проведение отбора по флуоресцентным параметрам образца.

Пример 1. Срез зерна кукурузы помещают в кювету спектрофлуориметра

МРФ-4, облучают его ультрафиолетовым светом при длине волны 281 нм, измеряют спектр флуоресценции образца в области

290-360 нм и определяют положение максимума флуоресценции по результатам анализа 3-5 индивидуальных эерновок каждого сортообразца. В качестве контрольных образцов используют зерно исходных линий кукурузы (+/+), а в качестве высокотриптофановых — зерно линий кукурузы, мутантной по гену опейк — 2 (о2/о2), Параллельно проводят определение триптофана в зерне известным способом. Полученные данные свидетельствуют о том, что для контрольных образцов максимум флуоресценции находится при 314-315 нм, тогда как установленные значения для высокотриптофановых аналогов достоверно выше и характеризуются интервалом 326-329 нм.

В табл.1 приведены значения максимумов флуоресценции срезов зерна.и содержание триптофана в зерне контрольных и высокотриптофановых образцов кукурузы

Пример 2. Аналогично примеру 1 проводят определение максимума флуоресценции размолотого зерна кукурузы при различных значениях длины волны возбуждения для контрольного (W155+/+) и высокотриптофанового (И/155 о2/о2) образцов.

В результате эксперимента установлено, что оптимальным интервалом, при котором возможен достоверный отбор высокотриптофановых аналогов, является область длин волн возбуждения 270-285 нм.

При значениях длины волны возбуждения меньше 270 нм уменьшается точность определения максимума флуоресценции из-за снижения его интенсивности, а при значениях длины волны возбуждения выше 285 нм уменьшаются различия между параметром контрольного и высокотриптофанового образцов и, тем самым, снижается достоверность отбора.

В табл.2 приведены данные о зависимости флуоресценции размолотого зерна кон-. трольных и высокотриптофановых образцов кукурузы от длины возбуждения.

Пример 3. Аналогично примеру 1 проводят определение максимума флуоресценции образцов размолотого зерна кукуру1741676

Таблица 1 зы исходной линии W64 А+/+ и эндоспермовых мутантов типа 02/о2, su2/su2, о2/о2

su2/su2 при длине волны возбуждения 281 нм. Установленные значения максимума флуоресценции (табл.З) показывают сте- 5 пень влияния различных эндоспермовых мутаций на изменение триптофэна в зерне.

Пример 4. Аналогично примеру 1 проводят измерение при длине волны возбуждения 281 нм и устанавливают вариа- 10 бельность максимума флуоресценции для срезов зерна исходной линии кукурузы Cr 2

+/+ и эндоспермовых мутантов типа о2/о2, wx/wx, о2/о2 wx/wx. Результаты даны в. табл.4. 15

Пример 5. Аналогично примеру 1. определяют значения максимума флуоресценции при длине волны возбуждения 281 нм и проводят оценку высокотриптофановых образцов муки двойных мутантов типа 20 о2/о2 su2/su2 на основе различных исходных генотипов кукурузы.

В табл,5 приведены значения максимумов флуоресценции размолотого зерна эндоспермовых мутантов кукурузы. 25

Пример 6. Аналогично примеру 1 проводят определение максимума флуоресценции при длине волны возбуждения 281 нм для срезов зерна гетерогенного селекци- 30 онного материала. B данном случае использованы семьи третьего года самоопыления (Яз), которые получены во ВНИИ кукурузы из 16 линейных синтетиков кукурузы, содержащих в своем генотипе мутант- 35 ный ген опейк-2. Полученные результаты приведены в табл.6 и показывают возможность проведения диагностики высокотриптофановых форм на гетерогенном селекционном материале. 40

Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит существенно упростить и ускорить проведение отбора путем исключения длительных и трудоемких операций по оценке содержания триптофана в зерне. При этом предлагаемый способ полностью исключает использование химических реагентов.

Установочный маркерный признак дает возможность проводить позерновочный экспресс-анализ без разрушения зерновки, что является важным при диагностике селекционного материала с ограниченным выходом зерна. Проведение отбора с использованием параметров флуоресценции позволит выявить высокотриптофэновые формы при генотипической вариабельности воздействия различных эндоспермовых мутаций, а также при практической селекции кукурузы с улучшенным качеством зерна.

Формула изобретения

1. Способ отбора высокотриптофановых генотипов кукурузы, включающий определение оптических параметров исследуемых образцов и идентификацию высокотриптофановых форм, отл ича ющи и с ятем, что, с целью упрощения и ускорения отбора, исследуемые образцы предварительно облучают ультрафиолетовым светом при длине волны 270-285 нм; в качестве оптического параметра определяют спектр флуоресценции при длине волны 290-360 нм, находят максимум флуоресценции и по его положению в интервале длин волн 326-330 нм идентифицируют высокотриптофановые формы.

2. Способ по п,1, отличающийся тем, что в качестве исследуемых образцов используют срезы зерна или размолотое зерно кукурузы.

1741676

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

1741676

Продолжение табл. 6

Составитель В.Феденко

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор М.Демчук

Редактор И.Шмакова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2229 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5