Штамм гибридных культивируемых клеток животных мus мusсulus - продуцент моноклональных антител против эритроцитарного антигена v f-системы крупного рогатого скота и родственных ему видов

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в племенном животноводстве для определения групп крови крупного рогатого скота (КРС). Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (Мон-АТ), против эритроцитарного антигена V F-системы КРС, повышение их специфичности и устойчивости при хранении. Полученный штамм депонирован под номером ВСКК(П) 188D и получил название IC8/18/2, Штамм получают путем гибридизации спленоцитов мыши Balb/c, иммунизированной эритроцитами КРС, содержащими Г-антиген F-системы КРС, с клетками мышиной миеломы SP 2/0- Ад 14. Клетки Mus. musculus IC8/18/2 культивируют в условиях in vitro или in vivo в мышах Balb/c для получения супернатантов культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки крови мышей, содержащих Мон-АТ против антигена V F-системы КРС, которые составляют основу реагента, используемого для определения антигена V. Мон-АТ представляют собой иммуноглобулины класса G3, накапливаются в асцитической жидкости в концентрациях, определяемых титрами 1: 4000 - 1:100000, не снижают активности при хранении в составе асцитической жидкости в течение 9 месяцев при (-10)-( 12)1 °С при трехкратном замораживании - оттаивании и лиофилизации. Помимо основной отрасли изобретение может найти применение в научных исследованиях и в судебной медицине С/ с vj 4 О v|

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. (21) 4753845/13 (22) 27.10.89 (46) 30.06.92. Бюл. N 24 (71) Институт цитологии АН СССР (72) Е.С.Завольная, А.M.Ìàøóðîâ, В.Б.Климович, Н. M.Êàçàêoâ, 3, С, Морозова.

Т.П.Швецова и Г.И.Амбарцемян (53) 578 085.23 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 1514770, кл. С 12 N 5/00. 1987. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS- ÏÐOÄÓÖÅÍÒ МОНОКЛОНАПЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА "V" F-СИСТЕМЫ

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И РОДСТВЕННЫХ ЕМУ ВИДОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в племенном животноводстве для определения групп крови крупного рогатого скота (КРС). Целью изобретения. является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (Мон-AT), против эритроцитарного антигена "Ч" F-системы КРС, повышение их специфичности и устойчивоИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в племенном животноводстве для определения групп крови крупного рогатого скота,.

Цель изобретения — получение штамма гибридных клеток, лродуцирующих моноклональные антитела (Мон-AT) против эритроцитарного антигена "Ч" F-системы крупного рогатого скота (КРС), повышение их специфичности и устойчивости при хранении. „„5U „„1744107 À1 сти при хранении, Полученный штамм депонирован под номером ВСКК(П) 188D и получил название 1С8/18/2. Штамм получают путем гибридизации спленоцитов мыши

Balb/c, иммунизированной эритроцитами

КРС, содержащими "V"-антиген F-системы

КРС, с клетками мышиной миеломы SP 2/OAg 14, Клетки Mus. musculus 1С8/18/2 культивируют в условиях 1и vitro или in vivo B мышах Ва1Ь/с для получения супернатантов культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки крови мышей, содержащих Мон-AT против антигена "V" F-системы

КРС, которые составляют основу реагента, используемого для определения антигена

"V Мон-AT представляют собой иммуноглобулины класса G3, накапливаются в асцитической жидкости в концентрациях, определяемых титрами 1 4000 — 1:100000, не снижают активности при хранении в составе асцитической жидкости в течение 9 месяцев при (-10К-12) С при трехкратном замораживании — оттаивании и лиофилизации. Помимо основной отрасли изобретение может найти применение в научных исследованиях и в судебной медицине, . Штамм получают следующим образом.

Спленоциты мыши линии Balb/с, имминиэированной эритроцитами КРС, содержащими "V" антиген F-системы КРС, гибридизируют с клетками мышной миеломы SP2/О-Ag 14 при соотношении числа спленоцитов к клеткам миеломы 14:1, Штамм отселектируют после двукратного реклонирования и к момвнту депонирования проводят через 33 пассажа in vitro и два пассажа in vivo.

1744107

25

35

50

Штамм депонирован под номером

ВСКК(П) 188Д и получил название!С8/18/2, .Штамм характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки, Клетки округлой формы, диаметром 20 — 30 мкм, располагаются раздельно, комками, гроздьями. Ядро одно, ядрышек 1 — 3. В кариотипе имеются хромосомы, подтверждающие происхождение от клеток нормальной мыши и мышиной миеломы SP2/О-А914.

Физиологические признаки, В условиях культивирования in vitro культура растет суспензионно на минеральных питательных средах, условно обозначаемых ПС. НПС и

КС.

Культивирование на ПС при посевной дозе 200-300 тыс,клеток/мл обеспечивает оптимальную плотность 600 — 700 тыс.клеток/мл через 24 — 30 ч и максимальную—

800-900 тыс.клеток/мл через 34 — 38 ч (в зависимости от условий культивирования).

Культура характеризуется слабыми адгезивными свойствами к стеклянной и пластиковой.поверхности.

В условиях культивирования in vivo a мышах Baib/c после внутрибрюшинной инокуляции 5 10 --10 клеток в мышь гиб6 7 ридомы образуют солидную, асцитную или смешанную формы опухоли, Асцитическая жидкость выделяется в количестве 2 — 6 мл из одной мыши. Секретирующая активность клеток характеризуется титром антител в культуральной среде. При оптимальной концентрации клеток в среде титр варьирует в пределах 1:2000 —.1:4000; при максимальной плотности — 1;4000-1:8000; в асцитичес кой жидкости — от 1:10000 до 1:64000 и в сыворотке крови мышей с развившимися опухолями от 1;20000 до 1:130000, После криоконсервации при — 196 С в культуре сохраняется 70-75% жизнеспособных клеток, при условии замораживания их в количестве 1-5 млн, в 1 мл эмбриональной сыворотки коров с добавлением 10% диметилсульфоксида (ДМ СО), Свойства секретируемого клетками продукта. Клетки штамма секретируют иммуноглобулины класса 63, определяемого изоферментным методом с использованием панели кроличьих антител против и изотопов в мышиных иммуношлобулинов: М, G1, G2a, 62в. Мон-AT отличаются высокоспецифичес«им средством к антигену "V" F-системы эритроцитов КРС, что доказывается проявлением гемолизирующей активности антител в отношении эритроцитов, на мембранах которых идентифицирован "V"-антиген, и отсутствием реакции с эритроцитами, негативными по данному антигену. Гемолиз происходит в присутствии комплемента кролика (слабее при использовании комплемента морской свинки).при 35-37 С через

1 — 2 ч или при 16 — 22 С через 6 — 24 ч после добавления комплемента кролика к смеси

МонАТ с эритроцитами.

Активность Мон-AT остается без изменений в составе асцитической жидкости или сыворотки крови мышей при хранении препаратов при (-70) и (-20) С или в лиофилизированном состоянии при 4 С в течение 24 мес. Титр препарата не снижается после трехкратного замораживания-оттаивания.

Пример 1. 1 млн клеток штамма после криоконсервации освобождают путем центрифугирования (1000 об!мин в течение

10 мин) от среды криоконсервации; пипеткой (1 мл) распределяют клетки по 200 тыс. в лунки (2 мл) 24-ячеечного планшета (Flow) на среду ПС, кондиционированную предварительно посеянными макрофагами. Планшет помещают в атмосферу 95% воздуха и

5% С02 при абсолютной влажности и 37 С.

Через 48 ч клетки из каждой лунки переносят во флаконы Карреля в 4 — 5 мл среды ПС, соблюдая при этом оптимальную посевную дозу 200 — 300 тыс.клеток в 1 мл. При достижении культуральной плотности 600-700 тыс. клеток/мл их рассеивают в свежую среду (ПС) во флаконы. В третьем пассаже ПС заменяют НПС или НПС с добавлением КС, Культуру пассируют до накопления 2550 млн.клеток, отделяют от среды, центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, отмывают в растворе Хэнкса (или ФР), центрифугируя 10 мин при 1000 об/мин, концентрируют 25 — 50 млн клеток в растворе

Хэнкса (или ФР) и вводят 8 — 10 недельным самцам мышей Balb/с внутрибрюшинно по

5-10 млн. клеток в мышь. Животных подготавливают к инокуляции клеток за 3 — 14 сут, введением внутрибрюшинно по 0,5 пристана (2,6. l0,14-тетраметилпентадекан), Через

12 — 14 сут мышей декапетируют, 1,5 — 2 мл крови нестерильно собирают в чашку Петри с раствором Хэнкса с добавлением

0,005 мгlмл гепарина, форменные элементы крови устраняют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об./мин. Иэ брюшинной полости стерильно извлекают асцитическую жидкость во флакон с гепаринизированным раствором Хэнкса. При этом соотношение асцитической жидкости и буферного раствора может варьировать в пределах 1:1 -1:4. Клетки гибридомы из асцитической жидкости отделяют центрифугированием (10 мин при 1000 об/мин), супернатант смешивают с сывороткой крови мышей, устанавливают титр Мон-АТ, добавляют 0,02-0,01% аэида натрия или

1744107. меркаптоэтанола и используют как реагент, Клетки, выделенные из асцитической жидкости, а также извлеченные из солидных опухолевых узлов, используют для повторной инокуляции. В результате первого пас- 5 сажа гибридомных клеток in vivo количество асцитической жидкости составляет 24 мл/мышь и увеличивается до 3-6 мл/мышь во втором пассаже.

Пример 2. Для установления специ- 10 фического сродства Мон-AT к "V"-антигену эритроцитарной мембраны KPC (или близкородственных видов) готовят 1,5% — 2,5% взвесь эдитроцитов в 0,85% ФР из крови

10 — 20 животных, генотипически положи- 15 тельных по "V"-антигену F-системы ("V+") и от 1 — 3 животных в эритроцитах которых не содержится "Ч" антиген ("V- ) животные хипируются ранее с использованием стандартных реагентов). В лунки планшетов для 20 иммунологическихх реакций вносят по

20 мкл ФР. Путем переноса из первой лунки в последующие получают разбавления реагента, кратные 2. Эритроцитарную взвесь вносят по 10 мкл в лунку, перемешивают 25 встряхиванием, добавляют в каждую лунку по 20 мкл комплемента кролика, перемешивают. встряхиванием, оставляют при 37—

38 C на 1 ч, встряхивают и оставляют еще на 1 ч. Полный гемолиз определяют по по- 30 явлению оранжевато-оплесцирующей окраске жидкости в лунках при одновременном исчезновении оформленных эритроцитов.

Анти-"V" специфичность обнаруживают по проявлению гемолиза в лунках с эритроци- 35 тами от "V+" - животных и отсутствию соответствующей реакции с "V-"-эритроцитами.

Параллельно с Мон-АТ в тех же условиях ставят аналогичную реакцию между "V+" и

"V-" эритроцитами и стандартным реаген- 40 том против "V" антигена. Получают результат, аналогичный результату с Мон-Ат для

"Ч+" эритроцитов, но отличающийся значительно более ниэКим титром для стандартного препарата. Титр Мон-AT-1C8 в 45 составе асцитической жидкости с добавлением сыворотки мышей колеблется в зависимости от условий постановки реакции от

1:500 до 1:130000, П.р и м е р 3. Для использования Мон- 50

AT в качестве реагента жидкости, полученной путем культивирования клеток in vivo, разбавляют буферным раствором Хэнкса

1:2-1:4, добавляют 0,01-0,02 азида натрия или мертиолата, устанавливают титр 55 антител, фасуют в ампулы по 1 мл, замораживают при (-10), (-12), -20) или (-70) С, При двух последних указанных температурах хранят более двух лет, при (-10), (-12) С—

8-12 мес. После размораживания реагент разбавляют ФР до титра 1:4-1;8 непосредственно перед употреблением. В случае необходимости хранения более 12 мес разбавленного реагента (титр 1:200 — 1:500) при оптимальных условиях реакции гемолиза) к ФР или раствору Хэнкса добавляют

10 — 7% бычьего сывороточного альбумина (hCA) и замораживают при тех же температурах, Сохранность активности реагента в течение сроков более двух лет при 4-6 С обеспечивают тем, что асцитическую жидкость, разбавленную раствором Хэнкса в 2 — 4 раза, лиофилизируют в вакууме при -70ОC и конической температуре 25 С. В целях использования в качестве реагента Мон-AT, полученных при культивировании клеток

in vitro, из культуральной среды антитела осаждают насыщенным раствором сульфата аммония, отмывают 0,01 фосфатным буфером (ЗФР, рН 7.2), диализуют против буфера, разбавляют раствором Хэнкса, добавляют 0,01 — 0,02% азида натрия или мертиолата устанавливают титр, замораживают или лиофилизируют, хранят как описано выше, Таким образом в результате предлагаемого изобретения, используемого в качестве источника Мон-АТ, получают реагент, характеризующийся высокой специфичностью к "Ч" антигену F-системы КРС и родственных ему видов, активность которого в

50 — 5000 раз превышает активность стэндартного препарата той же специфичности, производимого путем изоиммунизации коров эритроцитами животных того же вида, устойчивый к длительному хранению в условиях криоконсервации при периодическом оттаивании — повторном заМораживании или в условиях лиофилизации, и обеспечивают возможность практически бесконечного получения реагента и ротив эритроцитарного фактора "V" F-системы

KPC и родственных ему видов.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus ВСКК(П) 188Д— продуцент моноклональных антител против эритроцитарного антигена "V" F-системы крупного рогатого скота и родственных ему видов.