Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l., используемый для получения высокоспецифичных моноклональных антител к тиреотропному гормону человека

 

Использование: количественное определение тиреотропного гормона человека (ТТГ) в биологических жидкостях с диагностической целью. Сущность изобретения: предложен штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, используемый для получения моноклональных антител (МКА) к / -субъединице ТТГ. Концентрация МКА в культуоальной жидкости составляет 70 мкг/мл, в асцитной 5-7 мг/мл. 1 ил.

(19) (11) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s1)s С 12 N 5/00, С 12 P 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4865702/13 (22) 02.07.90 (46) 23.06.92. Бюл, ¹23 (71) Всесоюзный эндокринологический научный центр и Научно-производственное объединение "Биотехнология". (72) А;А.Булатов, Т.А.Осипова, А;В.Мартынов, Н.В.Смирнова, Р,Г.Василов, И.Ю,Втюрина и К.Ю.Вайль (53) 578.085,23 (088.8) (56) Benk!rane N.Ì, Воп О., Costaglloia S. et

aLMonocional antibody mapping of the

antigenic surface of human thyrotropin ап(1

its subunlts. — Endocrinology, 1987, ч.121, N

1, рр. 1171 — 1176.

Изобретение относится к биотехноло. гии и может быть использовано для определения содержания тиреотропного гормона . (ТТГ) человека в биологических жидкостях с целью диагностики гипотиреоза новорожденных и для дифференциальной диагностики гипер- и эутиреоза, Известны штаммы гибридных клеток, используемые для получения. моноклональных антител к ТТГ человека,Однако данные антитела перекрестно реагируют с другими родственными гормонами гликопротеиновой природы (лютеинизирующий (ЛГ) и фолликулостимулирующий (ФСГ) гормоны человека).

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus

musculus L, продуцирующего моноклональ. ные антитела (МКА) высокой специфичности по отношению к ТТГ человека и не дающие

2 (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК MUS MUSCULUS L,. ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТИРЕОТРОПНОМУ ГОРМОНУ ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: количественное определение тиреотропного гормона человека (ТТГ) в биологических жидкостях с диагностической целью. Сущность изобретения; предложен штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител (МКА) к Р -субъединице ТТГ. Концентрация

МКА в культУ0альной жидкости составляет

70 мкгlмл, в асцитной 5 — 7 мг/мл, 1 ил. перекрестных иммунологических реакций с

ЛГ и ФСГ человека.

На чертеже представлен график калибровочной кривой исследования ферментативной активности штамма.

Штамм получают:следующим образом, Мышей линии BaLB/с иммунизируют человеческим ТТГ путем трехкратного введения с интервалом в 13 дней в брюшную полость нитроцеллюлозного фильтра, на который нанесено 0,5 мкг ТТГ человека. После иммунизации у животных стерильно удаляют селезенку и готовят суспензию спленоцитов, Гибридизацию проводят путем слияния спленоцитов с клетками мышиНой миеломй Х 63.Ag.653 с помощью 5,$-ного полиэтиленгликоля мол.массы 4000, Соотношение клеток селезенки и клеток миеломы составляет 5:1. После гибридизации клетки высеивают в 24-луночные планшеты

1742324 па 5х10 кл на каждую лунку, селекцию проводят на среде ГАТ, содержащей 5,ь оленьей сыворотки. Для поддержания роста гибридных клеток в каждую лунку предварительно высевают перитонеальные макрофаги мыши (5х10 кл, на лунку). Культуральную жидкость из лунок с растущими клонами тестируют на наличие антител, специфичных к Р -субъединице ТТГ человека путем иммуноферментного анализа, В качестве антигена используют гормоны аденагипофиза: соматотропный арман (СТГ), ЛГ, ФСГ .человека, а также хорионический гонадотропин быка, Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к ТТГ и не дающие перекрестных реакций с ФСГ, ЛГ, СТГ и хорионическим гонадотропином быка, клонируют методом предельных разведений (1 кл на 3 лунки) в среде RPM1 1640, содержащей 10 $ эмбриональной телячьей сыворотки, 200 мМ глутамина, 5х10 . М 2меркаптоэтанола, 10 М гипоксантина и

1,6х10 M тимидина. Затем гибридный штамм, стабильно продуцирующий МКА, используют дгя наработки антител при культивировании in vitro u in vivo, Полученный штамм гибридных клеток обозначен T-32. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных под номером

448 Д и характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки, Стандартные условия выращивания: среда RPM1 1640, содержащая 10 /, эмбриональной телячьей сыворотки, 5x10 M 2-5 меркаптоэтанола, температура культивирования 37 С; газовая фаза — воздух +5 $

СО . Клетки культивируют в монослое в концентрации 5х10 — 10 кл/мл, время субкультивирования 2 — 3 дн.

Для получения асцита мышей линии

BaLB/с самок 12 — 14-недельного возраста обрабатывают пристаном по 0,5 мл внутрибрюшинно зэ 10 дн до прививки гибридных клеток. Клетки гибридом, отмытые средой

RPM1 1640, вводят внутрибрюшинно по

2х10 кл. на мышь. Время образования асцита 14 — 20 дн.

Данные видовой принадлежности, мышиные клетки BaL в/с.

Продукция M КА ста бил ьна на и ротяжении 25 пассажей в культуре и 5 пассажей на животных.

Характеристика целевого продукта, Штамм гибридных клеток Т-32 продуцирует моноклональные антитела подкласса

61, высокоспецифичные к TTI человека.

Специфичность оценивают иммуноферментнымметодом. МКАнереагируютсЛГ, ФСГ

55 иммуноглобулинов мыши, коньюгированных с пероксидазой хрена. После трехкратного промывания планшетов фосфаты буфером с Твин-20 в лунки добавляют

0,047;-ный раствор о-фенилендиаминэ в

0,2 М фосфатно-цитратном буфере (pH 5,0) с добавлением 0,012 перекиси водорода, После появления окраски реакцию в лунках останавливают раствором 2 М серной кислоты и проводят регистрацию ферментативи СТГ человека и с хорионическим ганадатропином быка, Способ криоконсервации: кориоконсервирование гибридамы T-32 проводят в ЭТС, 5 содержащей 157; ДМСО. Первые 3-е суток ампулы с клетками хранят при — 70 С, затем переносят в жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания составляет окало 407. Оценку жизнеспособности про10 водят путем подсчета клеток при их окрашивании 0,57-ным раствором трипанового синего, Пример 1, Определение специфичности MKA Т-32.

15 МКА против ТТГ человека получены из асцитной жидкости мышей линии BaLB/ñ, Из

1 мм асцита с помощью ионообменной хроматографии на колонке ДЭАЭ целлюлозой выделено 5 мг антител к ТТГ человека. Для

20 проверки специфичности моноклональных антител Т-32 исследуют их способность связывать родственные гормоны аденогипофиза человека (ЛГ и ФСГ), а также хорионический гонадотропин быка, ТТГ, ЛГ, 25 ФСГ, а также харионический гонадопропин человека и быка имеют общую а -цель, а

Р-цепи содержат аминокислотные последовательности,. индивидуальные для каждого гормона. Поэтому отсутствие перекрестной

30 реакции МКА Т-32 с ЛГ, ФСГ человека и хорионическим гонэдотропином быка при одновременном проведении ИФА с перечисленными гормонами является доказательством высокой специфичности МКА

35 T-32 по отношению к ТТГ человека и позволяет предположить, что указанные антитела скорее всего направлены к P субъединице гормона.

96-луночные планшеты инкубируют 1 ч

40 при 37 С с растворами ЛГ, ФСГ человека и хорионическим гормонам быка в концентрации 1 мкг/мл в карбонат — бикарбонатном . буфере 0,05 М, рН 9,6. Затем планшеты инкубируют с 0,5 Д-ным раствором желатины

45 в течение 1 ч при 37 С. После промывания

20 мМ фосфатным буфером с 0,05% Твин-20 в лунки вносят МКА (разведение 1:50000) и инкубируют 1 ч при 37 С. Затем лунки обрабатывают кроличьими антителами против

1742324 ной активности. MKA против ТТГ человека реагируют только с ТТГ человека и не реагируют с ЛГ, ФСГ человека и хорионическим гонадотропином быка. Из результатов анализа следует, что MKA Т-32 высокоспецифичны по отношению к ТТГ человека и скорее всего направлены к его P-субъединице.

Данные определения специфичности

MKA Т-32 к ТТГ человека приведены в таблице.

П р и м. е р 2. Использование МКА серии

Т-32 при определении ТТГ человека с помощью ИФА.

Для исследования возможности использования МКАТ-32 для определения ТТГ в сыворотке крови человека антитела сорбируют на микротитровальных планшетах в дистиллированной воде (рН 7,4) с концентрацией 20 — 40 мкгlмл. Затем в лунки вносят по 100 мл фосфатного буфера, содержащего

0,5 желатина, и инкубируют 1 ч при 37 С.

Планшеты промывают. Затем в лунки вносят известные концентрации гормона (100, 50, 25 мМЕ/мл), предварительно растворенного в сыворотке здоровых людей(содержание ТТГ 0 — 1 мМЕ/мл). После инкубации

1 ч при 37 С планшеты отмывают и добавляют в лунки по 50 мл кроличьих поликлональных антител, специфичных к ТТГ человека, 25

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus muscutus L; ВСКК(П) N 448Д, используемый для получения высокоспецифичных, моноклональных антител к тиреот30 ропному гормону человека. в концентрации 10 мкг/мл в фосфатном буфере, содержащем 0,27ь желатин. Инкубируют 1 ч при 37 С, планшеты тщательно промывают и добавляют в лунки коньюгат

5 высокоспецифических антител козла к. иммуноглобулинам кролика с пероксидазой хрена в 0,2; .-ном растворе желатины в фосфатном буфере. Планшеты инкубируют 1,5 ч при 37 С, промывают и добавляют субстрат

10 для развития ферментативной реакции(офенилендиамин в Na-цитратфосфатном буфере, содержащем 0,012ф, перекиси водорода). Через 20 — 30 мин после развития окраски реакцию останавливают, добавляя

15 в лунки 107ь-ную серную кислоту и проводят регистрацию ферментативной активности при 492 нм. По. полученным значениям оптической плотности строят калибровочные .кривые, по которым видно, что аффинность

20 MKA Т-32 достаточна для создания иммуноферментной тест-системы для определения

ТТГ в диапазоне от 2,4 до 50 мМЕ/мл в биологических жидкостях человека.

1742324

Составитель Т. Осипова

Редактор И. Дербак Техред M,Moðãåíòàë Корректор Н. Ревская

Заказ 2261 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушскэя наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101