Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих

 

Использование: биотехнология, состав сред, используемых для культивирования клеток животных. Сущность изобретения: в питательную среду для культивирования клеток животной ткани, содержащую гидролизат белковогосырья, аминокислоты, витамины, минеральные соли , глюкозу и сыворотку крупного рогатого скота, дополнительно вводят поливинилпирролидон, содержание холинхлорида увеличивают, а в качестве гидролизата белкового материала используют ферментативный гидролизат казеина.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ ЬСТВУ (21) 4775229/13 (22) 22.11.89 (46) 23.05.92. Бюл, N 19 (71) Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии (72) А,И,Коренева и А.С.Пригода (53) 578,085,23(088.8) (56) Совершенствование технологии микро.биологических производств. — М.: 1983, с. 45-52, Авторское свидетельство СССР

N1143078,,кл. С 12 N 1/00, 1983.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к составу сред. используемых для клеточных культур.

Целью изобретения является упрощение состава среды.

Способ получения предлагаемой питательной среды заключается в том, что предварительно готовят ферментативный гидролизат казеина путем обработки исходного материала ферментным препаратом в специально подобранных условиях, отделения взвешенных частиц и осветления полученной жидкости активированным углем.

После получения ферментативного гидролизата казеина в деионизированной воде последовательно растворяют все необходимые компоненты и доводят рН среды до 6,9 продувкой углекислым газом. Питательную среду подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр, Пример 1. Технический кислотный казеин I-го сорта (ГОСТ 17626-72) помещают в количестве 100 r в коническую колбу вместимостью 2 л, заливают 2 л дистиллированной воды и выдерживают при комнатной

„„ Ы„„1735360 А1 (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ (57) Использование: биотехнология, состав сред, используемых для культивирования клеток животных. Сущность изобретения; в питательную среду для культивирования клеток животной ткани, содержащую гидролизат белкового сырья, аминокислоты, витамины, минеральные соли, глюкозу и сыворотку крупного рогатого скота, дополнительно вводят поливинилпирролидон, содержание холинхлорида увеличивают, а в качестве гидролизата белкового материала используют ферментативный гидролизат казеина. температуре в течение 3 ч, Затем меняют воду на свежую, подогретую до 40 С, добавляют 20 г бикарбоната натрия и перемешивают до получения однородной суспензии, Доводят рН до 8,0. Гидролиз проводят панкреатином для производства сывороток (МРТУ 42 N 5046-65), который помещают в колбы емкостью 250 мл по 0,5 г. Потом в колбы разливают по 100 мл суспензии казеина и проводят гидролиз на термостатируемой качалке в течение 2 ч при 40 С.

Гидролиз прекращают прогреванием колб в водяной бане при 750С в течение 10 мин, Отделение взвешенных частиц проводят центрифугированием при 100009 в течение

15 мин. Затем осветляют гидролизат активным углем марки ОУ-А в течение 30 мин, используя 30 г сорбента на 1 л гидролизата.

По окончании сорбции гидролизат казеина последовательно фильтруют через картон и мембранный фильтр.

Возможно применение ферментного препарата типа протосубтилина Г10Х.

Готовят питательную среду на деионизированной воде, последовательно раство1735360 ряют соли, глюкозу, аминокислоты, ферментативный гидролизат казеина, витамины, фенолрот. Затем доводят рН среды до 6,9 продувкой углекислым газом, после чего добавляют 107-ный раствор поливинилпир- 5 ролидона из расчета 20 мл на 1 л питательной среды, а также сыворотку крови крупного рогатого скота, антибиотик.

Питательную среду фильтруют через мембранные фильтры с размером пор 10

0,45 мкм и 0,22 мкм при избыточном давлении 0,5-1,0 ати. Готовая питательная среда должна храниться при 4-6 С, Клетки BHK-21 (С-13) суспензионно культивируют в конических колбах емкостью 250 мл при объ- 15 еме заполнения 70 мл под резиновыми пробками на термостатируемой качалке (180 об/мин, амплитуда 20 мм) при 35»

» 0,5 С. Продолжительность каждого пассажа равна 72 ч, всего проведено 29 пассажей. 20

Начальная концентрация клеток в пассажах составила (0,4» 0,1) 10 кл/л, средняя конечg ная концентрация клеток равна (2,4» 0,1)х х10 кл/л, количество жизнеспособных клеток в пассажах на уровне 99 . 25

Пропись питательной среды

Наименование КонцентраЦИМ компонентов (-аргинин. 0,115

L-глутамин 0.584

L-триптофан 0,015

L-цистин 0,042

Холинхлорид 0,050

Фолиевая кислота 0,003

Никотинамид 0,003

П и ридо ксал ь H C I 0.003

Тиамин HCI 0,003

Пантотенат кальция 0,003

Инозит 0,006

Ферментативн ый гидролизат казеина 3.0

Высокомолекулярный поливинилпирролидон 2.0

Сыворотка крови крупного рогатого скота 10,0

Глюкоза 4,500

Хлористый кальций (Са С!г) 0,09

Хлористый калий (KCI) 0,36

Сернокислый семиводный магний (Mg SO4 7Н20) 0,18

Двухуглекислый натрий (МаНСОз) 2.500

Хлористый натрий (Na CI) 5.880

Фосфорнокислый однозамещенный натрий

0,140

0,010

0,100 (NaHzPO4 2Н20)

Феноловый красный

Сульфат канамицина

Деминерализованная вода до 1 л.

Пример 2, Готовят питательную среду как описано в примере 1. Клетки ВНК-21 суспензионно культивируют в ферментере емкостью 5 л при обьеме заполнения 3 л.

Температура культивирования составляет

35,5»-0,5 С. Скорость вращения мешалки

145»-5 об/мин. Продолжительность каждого пассажа равна 72 ч, всего было проведено

6 последовательных пассажей. Начальная концентрация клеток (0,4»0,1) 10 кл/л, средняя конечная концентрация клеток (2,5» 0,1)-10 кл/л, при этом в конце каждого пассажа количество жизнеспособных клеток в культуре составляет 98-99 .

Пример 3. а) Готовят питательную среду, как описано в примере 1. Однако ферментативный гидролизат казеина не вводят в ее состав. Клетки ВНК-21 культивируют суспензионным способом в колбах вместимостью 250 мл как описано в примере 1. Начальная концентрация клеток составляет (0,4»0,1) 10 кл/л. конечная.

9 концентрация — (0,4» 0,1).10 кл/л, т.е. в от9 сутствие ферментативного гидролизата казеина роста клеток не наблюдается. б) Готовят питательную среду как описано в примере 1. Однако в ее состав не вводят псливинилпирролидон. Клетки ВНК-21 выращивают в суспензии как описано в примере 1, Начальная концентрация клеток составляет(0,4» 0,1) 10 кл/л, клетки дегене9 рируют в течение первого пассажа. остаточное содержание клеток (0,07-0,08) ° 10 кл/л, g в поле зрения были видны разрушенные клетки. Таким образом, в отсутствие поливинилпирролидона роста клеток не наблюдается. в) Готовят питательную среду как описано в примере 1. Однако содержание холинхлорида не увеличивают до 50 мг/л, а сохраняют на уровне исходной среды. Клетки ВНК-21 культивируют в колбах как описано в примере 1. Начальная концентрация клеток (0,4» 0,1) 10 кл/л, конечная — (0,4»»-0,1) 10 кл/л. Таким образом, при таком содержании холинхлорида рост клеток не осуществляется, Формула изобретения

Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих, содержащая гидролизат белкового материала, аминокислоты. витамины, минеральные соли, глюкозу и сыворотку крупного рогатого скота, о т л и ч аю щ а я с я тем, что, с целью упрощения

1735360

0,140

0,010

0,1 до 1 л

30

40

50

Составитель А, Коренева

Техред М,Моргентал Корректор T. Малец

Редактор А. Лежнина

Заказ 1793 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва. Ж-35. Раушская наб.; 4/5.

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, yn,Гагарина, 101 состава среды, дополнительно вводят поливинилпирролидон, а в качестве гидролизата белкового материала используют ферментативный гидролизат казеина. при следующем соотношении компонентов, г/л; 5 (=аргинин 0,115

1=глутамин 0,584

L-триптофан 0,015

L-цистин 0,042

Холинхлорид 0,050 10

Фолиевая кислота 0,003

Никотинамид 0,003

Пиридоксаль НС! 0,003

Тиамин HCI 0,003

Пантотенат кальция 0,003

Инозит 0,006

Ферментативный гидролизат казеина 3,0

Высокомолекулярный поливинилпирролидон 2.0 20

Сыворотка крови крупного рогатого скота 10,0

Глюкоза 4,500

Хлористый кальций (Са С!г) 0,090

Хлористый калий (KCI) 0,360

Сернокислый семиводный магний (MgSO4 .7HzO) 0,180

Двухуглекислый натрий (Na Н СОз) 2,500

Хлористый натрий (Na CI) 5,880

Фосфорнокислый однозамещенный натрий (NaHzPO4 2Н О)

Феноловый красный

Сульфат канамицина

Деминерализованная вода